暴露疾病信息的，除了短片段cfDNA，还有长片段非凋亡cfDNA

cfDNA与液体活检

随着“液体活检”的兴起，循环游离DNA（cfDNA）的应用越来越多。例如在临床上应用于辅助诊断癌症、预测和监测癌症药物治疗效果、鉴别胎儿机体异常、评估移植器官的健康性等。

但是由于cfDNA在血液中含量非常低，抽提得率低，传统方法往往是通过增大血液上样量来满足下游实验需求，但是实际上能从孕妇和病人处得到的样本量是有限的。那么如何提高得率、从体积有限的临床血液样本中获取足够多的cfDNA和更多信息呢？此外，传统方法提取的cfDNA通常是150-200bp左右的细胞凋亡产生的cfDNA，其实还有一部分少量存在的长片段cfDNA被漏掉了，而这一部分对于后续疾病监测是非常有用的，如检测癌症患者是否存在耐药性突变等。

cfDNA的来源

这一部分大于200bp的cfDNA是如何产生的呢？我们先来了解下。目前的研究发现cfDNA的来源主要有三种：cfDNA一种是来自于细胞主动裂解（细胞凋亡）过程中产生的片段化核酸，大小基本上在150-200bp左右（单核小体cfDNA）或它的二倍、三倍片段（核小体复合体），多数传统cfDNA提取试剂盒提取的是这一部分凋亡cfDNA；另一种cfDNA是来自于细胞被动裂解（细胞坏死）——来源于外界理化刺激引发的细胞群坏死，或者是自身免疫系统对细胞的杀伤作用。但不同的是这个过程产生的为长片段cfDNA，会接近基因组DNA大小；此外还有部分cfDNA来源于肿瘤细胞的外分泌（参见下图1）。而长片段cfDNA部分对于肿瘤学监测很重要——揭示出现的突变。

 
图1. 血液中多种肿瘤细胞来源的cfDNA存在形式

Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: Nature Reviews Cancer 11: 426-437, copyright (2011)

长片段cfDNA的意义

对于癌症治疗，如果一种药物正在杀死癌细胞，那么这个凋亡部分就是你会观察到释放到血浆中的短片段cfDNA部分。即便如此，癌症经常在化疗药物的选择性压力下发生突变，从而使它们对化疗产生抗药性（EGFR抑制剂就是一个很好的例子）。这些含有二次或三次突变的耐药细胞不会通过细胞凋亡而死亡，因此不会有细胞凋亡部分cfDNA。然而，由于大多数提取试剂盒提取的仅是细胞凋亡部分产生的短片段cfDNA，而错过细胞坏死等产生的长片段cfDNA，因而将错过这些新出现的突变！当cfDNA被用于监测癌症患者的状态以判断是否有任何变化时，这是非常重要的。

Covaris cfDNA提取

Covaris truXTRAC® cfDNA提取试剂盒配合Covaris自动聚焦超声技术（Adaptive Focused Acoustics，AFA) ，主动解交联提取cfDNA，相比传统方法，cfDNA提取的得率、质量和复杂度都得到显著提高，更少的血液量即可满足下游检测分析需求。同时除提取单核小体凋亡cfDNA外，还可获取血液中少量存在的核小体二聚体、三聚体cfDNA和非凋亡长片段cfDNA，帮助后续研究获取更多疾病相关信息！

truXTRAC® 获取的cfDNA种类更丰富

 
图2.不同cfDNA提取方法获得cfDNA片段分析

用truXTRAC cfDNA和传统柱提取法Q试剂盒从相同临床血液样本中提取的cfDNA通过Fragment Analyzer(AATI)分析。结果显示truXTRAC cfDNA试剂盒配合AFA技术，无基因组DNA污染，除提取到单核小体凋亡cfDNA外，还获得了血液中少量存在的核小体二聚体、三聚体cfDNA片段和非凋亡长片段cfDNA，帮助后续研究获得更多信息，如检测癌症患者是否存在耐药性突变等。

truXTRAC® 显著提高cfDNA得率

 
图3. 不同cfDNA提取方法得率比较

用truXTRAC cfDNA和传统柱提取法Q试剂盒从相同10个临床血液样本提取cfDNA。cfDNA得率使用Qbit检测，柱状图表示得率范围，X表示10个供体cfDNA得率的平均值。结果显示Covaris truXTRAC cfDNA试剂盒配合AFA技术，显著提高cfDNA得率。

truXTRAC®显著提高cfDNA文库复杂度

 
图4.不同cfDNA提取方法文库复杂度比较

与Q试剂盒提取的cfDNA相比，同样的起始量建库，truXTRAC提取的cfDNA构建的文库复杂度更好。起始DNA量越多，扩增越少，文库复杂度越好。

总结

truXTRAC® cfDNA提取试剂盒配合AFA技术主动提取：
1.主动解交联组蛋白、蛋白质、细胞外碎片与cfDNA的共价交联复合物，显著
2.提高cfDNA产量和质量，相较传统方法得率提高70%；
3.获得信息更丰富，文库复杂度更高，除提取单核小体凋亡cfDNA外，还可获取血液中少量存在的核小体二聚体、三聚体cfDNA和非凋亡长片段cfDNA；
4.1-4ml，更少的血液量即可满足下游应用需求；
5.无需Carrier RNA，避免对下游检测的干扰；
6.室温操作，无需真空抽滤，仅需45min即可完成；
7.标准化流程，非接触，无污染，重复性高，易于高通量拓展。

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参考文献：
[1] Fariz Nurwidya ,etal. Circulating tumorcell and cell-free circulating tumor DNA in lung cancer. CMJ 2016
[2] Giulia Siravegna and Alberto Bardelli. Genotyping cell-free tumor DNA in the blood todetect residualdisease and drug resistance. Genome Biology 2014.
[3] Jahr S, Hentze H, Englisch S, etal. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells.
Cancer Res 2001.