制备基因敲除动物的秘密武器:电穿孔

【字体: 时间:2018年09月14日 来源:生物通

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  近年来,生命科学领域涌现出许多突破性的成果,在此过程中基因敲除小鼠功不可没。基因编辑技术的进展固然吸引眼球,但另一项技术也起着至关重要的作用,那就是电穿孔。

基因敲除(转基因)小鼠是指遗传修饰过的实验室小鼠,它们的某些基因失活、去除或人为引入。在研究某些基因的功能时,它们已成为不可或缺的一部分,从癌症探索到成瘾研究。研究人员通常在敲除某个基因之后,观察小鼠的行为、健康状况和生物标志物,为基因功能提供线索,从而了解疾病和行为背后的机制。

1989年,Mario Capecchi、Martin Evans和Oliver Smithies创造了第一只基因敲除的小鼠,这也让他们在2007年获得了诺贝尔生理学/医学奖。基因组编辑在近几年获得广泛关注,CRISPR-Cas9更是频频登上头条。不过,另一种技术也不容忽视,它利用电穿孔来打通细胞膜,将DNA等分子引入细胞。

电穿孔(electroporation)一种将电场施加到细胞膜上以增加其渗透性的方法。这允许DNA等分子通过电穿孔在膜上形成的小孔而进入细胞。在建立基因敲除小鼠的过程中,它也是重要的一环。

当然,基因敲除小鼠模型也存在局限。比如小鼠发育和基因型鉴定需要时间,而小鼠基因组的其他部分也可能带来表观遗传影响。然而,由于它们的制备过程相对简单,并且它们在研究中无处不在,因此基因敲除小鼠已经成为近年来遗传研究中最成功的动物模型。

基因敲除小鼠

2007年,犹他大学医学院的Mario Capecchi教授及其同事详细介绍了基因敲除小鼠的制备方法,详见诺贝尔奖的官方网站。这个过程中的两个重要步骤:设计(基因编辑)和导入(电穿孔),在近几年都迅速发展。

人们通常要设计目标载体,包括从基因文库中分离待敲除的基因并设计一段新的序列,这段序列要彻底改变,表现为无活性,但又要足够相似,以便掺入到小鼠目标序列中。另外,人们还添加标记基因,如荧光报告基因或neo基因,这些基因产生可观察到的变化,便于进一步的选择。近年来,CRISPR-Cas9、ZFN和TALEN已成为转基因生物开发过程中最成功的基因编辑方法。

研究人员随后利用电穿孔或显微注射将重组载体导入胚胎干细胞,使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中,从而实现表达。一般来说,显微注射命中率较高,但技术难度大,电穿孔命中率比显微注射低,但便于使用。

最近,日本京都大学和广岛大学的研究人员在《Scientific Reports》杂志上介绍了一种新方法 – 通过电穿孔来获得基因敲除动物的技术(TAKE)。这种方法通过电穿孔直接引入经过修饰的核酸内切酶,从而获得基因敲除的大鼠。

在这项研究中,研究人员使用了NEPA 21电穿孔仪。这种仪器采用三步脉冲:第一个脉冲在细胞膜上形成小孔,第二个脉冲将目标序列送入胚胎,而第三个改变极性,以确保导入整条mRNA序列。结果表明,电穿孔方法使得胚胎存活率达到91%,基因组编辑率达到73%,与传统的显微注射方法相比都提高了两倍以上。

有时候,基因编辑的进步也需要电穿孔方法的配合。加州大学伯克利分校的研究人员最近开发出一种名为CRISPR-EZ的新系统,它已被证明能够以100%的效率将CRISPR修饰的基因导入小鼠胚胎。

这项研究成果发表在《Journal of Biological Chemistry》杂志上,展示了如何将新的基因编辑技术与电穿孔方法相结合,才能更有效地生成转基因模型。

一些转基因CRISPR研究的传统做法是通过显微注射将CRISPR-Cas9导入目标胚胎。这种方法通过修饰胚胎本身的DNA来缩短基因敲除小鼠的制备过程。然而,显微注射会导致胚胎的活力低,并且既昂贵又耗时。为了克服这一点,研究人员利用电穿孔将CRISPR导入胚胎,产生了更多的转基因小鼠。这主要是因为与显微注射的胚胎相比,电穿孔胚胎的活力增加。

这种方法不仅更有效,也更经济。作者认为:“在过去,至少需要花费25,000美元和6个月的时间来制备基因敲除小鼠。通过CRISPR-EZ等改进,成本和时间都至少下降10倍。这些技术创新让小鼠成为人类疾病建模的强大工具。”

其实,不光是基因编辑,还有基因插入,它们推动了基因敲除动物的技术进步。眼下,这些快速发展的领域相互配合,加速了世界各地的研究进程,从而帮助人们应对健康领域面临的挑战。

相关文献

1 Kaneko T, Sakuma T, Yamamoto T, Mashimo T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci. Rep.  4, 6382 (2014).

2 Chen S, Lee B, Lee AYF, Modzelewski AJ, He L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J. Biol. Chem. 291, 14457–14467 (2016).

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