Crystal数字PCR三通道检测HER-2基因拷贝数变异方法的建立

【字体: 时间:2018年09月29日 来源:深蓝云

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  HER2的扩增情况是乳腺癌中靶向治疗中至关重要的指标,但是评估HER2拷贝数变异时,肿瘤DNA被来源于健康细胞的DNA中稀释,所以在检测时非常具有挑战性。Crystal 数字PCR技术为提高HER-2拷贝数变异检测的准确性提供了很好的解决方案。

乳腺癌是女性排名第一位的常见恶性肿瘤。据2016年国家癌症中心统计显示,全国新发乳腺癌病例数达27.24万,每年死亡率超过7万。其中15%-25%的乳腺癌患者显示为HER-2基因过表达。HER-2/neu(又称c-erbB-2)基因为表皮生长因子受体家族成员之一,是一种原癌基因,研究表明,HER-2/neu基因扩增或过表达的乳腺癌患者易早期复发且生存期缩短。检测HER-2基因是否高表达对于患者的预后判断、治疗方案的选择具有重要意义,HER-2是乳腺癌明确的预后指标和药物治疗效果的预测指标。

三色荧光通道Crystal微滴芯片数字PCR检测HER2拷贝数扩增

HER2的扩增情况是乳腺癌中靶向治疗中至关重要的指标,但是评估HER2拷贝数变异时,肿瘤DNA被来源于健康细胞的DNA中稀释,所以在检测时非常具有挑战性。Crystal 数字PCR技术为提高HER-2拷贝数变异检测的准确性提供了很好的解决方案。Crystal数字PCR采用创新的微滴化技术,将含有DNA或RNA的PCR反应体系分成约20,000-30,000个微滴。经PCR扩增后,逐个对每个微反应进行检测,有荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0,根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

接下来我们介绍Crystal微滴芯片数字PCR如何可靠地识别肿瘤微小病灶样本中的HER2扩增情况?

我们将之前报道的Assay在Crystal数字PCR平台进行优化,检测17号染色体上的HER2(ERBB2)和MRMM1,以及2号染色体上的TSN(内参基因)[1]。这种检测方法能够绝对定量HER2拷贝数,并区分HER2扩增和17号染色体多倍体,避免HER2扩增情况被错误评估。

HER2扩增检测的灵敏度

从SKBR3细胞株(HER2/TSN比例为10:1)中提取的基因组DNA,掺入正常基因组DNA中达到从1%到12%的突变频率,建立HER2/TSN比值从1~2.2的模型。

使用泊松公式计算TSN和HER2的绝对浓度,并应用Z-检验对log HER2 / TSN比值(呈近似正态分布)表征突变DNA量进行显著性检验(α=β= 5%)[2]。通过这种方法,我们能够显著地检测突变DNA的存在,灵敏度可达2%,对应HER2/TSN比值为1.2。

图1.不同HER2 / TSN比值的样本检测(*α=β= 5%,具有统计学意义)。 总DNA浓度为2.5ng /反应(760cp /μL)。样本利用限制性内切酶片段化后在Crystal数字PCR平台进行检测三重实验。

乳腺癌患者样本中HER2扩增和17号染色体多倍体的检测

目前肿瘤样品中HER2扩增的方法依赖于免疫组织化学(IHC)来评估HER2过表达,对于IHC不明确的结果HER2表达(IHC2+),需要通过荧光原位杂交(FISH)检测Her2基因扩增进行检测。两种方法均操作繁复,且需要高度专业的知识进行后续分析。分子生物学方法是更简单、更快速、更公正的替代法。

本研究使用法国Gustave Roussy研究所提供的7例乳腺癌患者样本中提取的DNA进行检测,并将Crystal数字PCR获得的结果与标准诊断程序获得的结果进行比较。

图2.使用标准诊断程序(IHC和FISH)(A)和通过Crystal数字PCR(B)对患者1-7进行HER2扩增评级。

用IHC/FISH和Crystal 数字PCR对1-4号患者样本(两种方法均认为HER2扩增为阳性)和来自6号和7号患者样本(HER2扩增为阴性)所得结果一致。Crystal 数字PCR同时检测出了6号患者的染色体17号染色体多倍体情况。

但是标准诊断程序检测到了5号患者样本中HER2的扩增,Crystal数字PCR检测出由于17号染色体多体性而导致的HER2信号升高。

与其他数字PCR平台的比较

利用独立开发Her2基因检测Assay,通过16个乳腺癌患者样本的检测与IHC方法和不同数字PCR技术进行比较,Crystal 数字PCR技术检测HER-2的方法灵敏度达75%,特异性达92%,与IHC标准方法结果一致,与其他数字PCR技术相比,灵敏度更高[3]。

同时能够克服细胞学方法所涉及的异质性问题,操作更为简单,成本较传统方法下降75%。

图3.16位乳腺癌患者不同数字PCR技术比较结果

参考文献:
[1] Jacquemier et al. “SISH/CISH or qPCR as alternative techniques to FISH for determination of HER2 amplification status on breast tumors core needle biopsies: a multicenter experience based on 840 cases”. BMC Cancer. 2013;13:351. PMID: 23875536
[2] Whale et al. “Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation”. Nucleic Acids Res. 2012;40:11. PMID: 22373922
§ Courtesy of Dr Cécile Jovelet, Translational Research Laboratory, Institut Gustave Roussy, France
[3]第五届微流控芯片高端论坛墙报,2017;

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