利用液体活检来发现癌症的生物标志物

【字体: 时间:2019年11月21日 来源:生物通

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  Illumina第一款可用于全景基因组变异分析的液体活检产品,包括肿瘤突变负荷(TMB)和微卫星不稳定性(MSI)的检测。

随着分子方法的不断改进,人们已经可以利用血浆样本中的游离DNA(cfDNA)来分析实体瘤中的体细胞变异。新一代测序(NGS)技术不仅具有检测低水平变异所需的灵敏度和准确性,还具有在单次检测中评估多种变异的能力(图1)。无创的血浆检测已成为组织检测的有力补充,能够随时间变化评估多个样本,包括那些难以获取的组织。


图1:液体活检实现了多类变异和多种癌症的生物标志物分析——先进的纠错算法和深度测序
能够检测cfDNA中的关键标志物,检测限低至0.5%的变异等位基因频率。

随着NGS方法的优化,无创检测有望检测到组织新部位和基因组新位置上产生的突变。胃肠道癌和非小细胞肺癌的研究表明,cfDNA分析不仅与组织分析高度一致,而且能检测到配对组织活检中未发现的大量生物标志物和耐药性改变1,2。

TruSight Oncology 500 ctDNA能够利用30 ng cfDNA,在无创检测中评估多个类别的变异,包括单核苷酸变异(SNV)、插入缺失(indel)、拷贝数变异(CNV)、DNA融合、微卫星不稳定性(MSI)以及肿瘤突变负荷(TMB)(表2,图1)。TruSight Oncology 500 ctDNA利用超快速的DRAGEN™ Bio-IT平台进行数据分析。从DNA文库制备到汇总的变异报告,整个流程可在5天内完成(图2)。

表1:TruSight Oncology 500 ctDNA的产品规格

参数

详细信息

系统

NovaSeq™ 6000系统

Panel大小

1.94 Mb DNA

样本类型

血浆

DNA起始量

30 ng cfDNA

检测时间

5天,从文库制备到变异报告

运行时间

36小时运行、8小时分析(S2流动槽)

45小时运行、22小时分析(S4流动槽)

样本通量

8个样本/运行(S2流动槽)

24个样本/运行(S4流动槽)

测序运行

2 x 150 bp循环,800M双端reads

试剂盒规格

48个样本


近期大型队列研究使用的全景基因组分析已表明,多达90%的样本存在可提供信息的改变3-8。由于返回结果的时间有限,且获取组织的机会有限,因此全面评估各种生物标志物的检测产品增加了从单个样本中获得相关信息的机会。TruSight Oncology 500 ctDNA实现了cfDNA的全景基因组分析。在组织检测并非最佳的情况下,这款基于血浆的检测产品可用于分析耐药性标志物,支持纵向监测,并鉴定相关的生物标志物。


图2:NGS流程——TruSight Oncology 500 ctDNA检测可整合到现有的实验室流程中,从核酸到变异检出只需5天。

利用肿瘤界公认权威机构的信息来设计内容,既包括当前指南中的生物标志物,也包括新兴的生物标志物,全面覆盖多个肿瘤的关键指南和临床试验所涉及到的基因。以成熟的Illumina技术对可能在肿瘤发生中起作用的变异开展cfDNA分析,TruSight Oncology 500 ctDNA的全面内容为未来肿瘤诊断方案的开发奠定了坚实的基础。

表2:TruSight Oncology 500 ctDNA所检测的变异

变异类型

示例

SNVindel

EGFR exon 19, BRAF V600E, EGFR T790M

DNA融合

ALK, ROS1, NTRK, RET

CNV

HER2

MSI

MSI-High

TMB

TMB-High


错误纠正实现了低水平标志物的准确检测

TruSight Oncology 500 ctDNA的文库制备是基于成熟的靶向富集技术,利用生物素化探针和链霉亲和素包被磁珠从DNA文库中纯化选定的靶点。靶向富集技术的好处在于使用足够大的探针来赋予高的结合特异性,同时能够与含有少量突变的靶点杂交。当天然的等位基因变异和序列假象存在时,这种机制减少了样本丢失。

由于循环肿瘤DNA(ctDNA)仅占游离DNA的一小部分,故人们需要有效的方法将信号与噪声分离。TruSight Oncology 500 ctDNA检测可实现更深度的测序(> 35,000倍),以增强检测灵敏度。文库制备也融合了分子条形码(UMI),这些条形码可用在数据分析中,以减少固有的测序错误11。在检出超低频率的突变时,维持高特异性(低假阳性)也是关键。UMI的引入让变异等位基因频率(VAF)低至0.5%的突变检测得以实现,且灵敏度达到95%,特异性高于99.995%(表3)。数据分析软件(在单独出售的DRAGEN Bio-IT平台上运行)在变异检出之前执行了先进的错误纠正。

表3:高准确性地检测低水平变异

变异类型

灵敏度

特异性

小的变异(≥ 0.5% VAF

95%

99.995%

基因扩增(≥ 1.4倍变化)

95%

95%

基因缺失(≥ 0.6倍变化)

95%

95%

基因重排

95%

95%

MSI检测(≥ 肿瘤的2%

95%

95%


为了在VAF低至0.5%时达到> 95%的灵敏度,利用30 ng cfDNA对TruSight Oncology 500 ctDNA的性能进行了验证(序列覆盖度为35,000倍),这个起始量是基于血浆样本的预期产量。如果cfDNA的产量更高,则此产品也很理想。假如起始量高于或低于建议值,则理论上灵敏度会相应提高或降低(表4)。

表4:不同起始量和检测限的预计灵敏度

起始量(cfDNA)

变异等位基因频率

0.20%

0.30%

0.40%

0.50%

0.60%

0.70%

0.80%

0.90%

1.00%

10 ng

38.46

59.39

74.54

84.57

90.88

94.71

96.97

98.29

99.04

30 ng

90.83

98.27

99.70

99.95

99.99

100.00

100.00

100.00

100.00

50 ng

99.02

99.95

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

70 ng

99.91

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

100 ng

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

100.00

Calculations based upon 35,000x coverage for small hotspot variants. Hotspot variants occur > 50 in the COSMIC database.

全面的内容设计

TruSight Oncology 500 ctDNA panel包含了一份详尽的生物标志物列表,这些标志物通常在多种类型的肿瘤中突变。利用单个样本在单次检测中就能评估与特定肿瘤类型相关的各种生物标志物(SNV、indel、DNA融合、CNV、TMB、MSI)。它采用的探针能够捕获已知和新颖的基因融合。TruSight Oncology 500 ctDNA panel包含523个基因用于变异检测。关于完整的基因列表,请访问www.illumina.com/tso500-ctDNA

DRAGEN Bio-IT平台让分析流程加速

DRAGEN平台上增强的硬件和软件将数据分析的时间从9天缩短到20个小时(表5)。利用一套先进的专有算法,DRAGEN平台针对TruSight Oncology ctDNA检测的使用而优化,可以开展比对、带纠错的折叠,以及包括TMB和MSI在内的变异检出。基于qPCR和IHC的MSI检测往往带来定性的结果,而TruSight Oncology 500 ctDNA根据70多个均聚物MSI标志物位点提供了定量的MSI评分。对于TMB分析,TruSight Oncology 500 ctDNA通过测定非同义和同义SNV和indel来优化灵敏度。在检出变异和纠正错误之后,通过过滤生殖系变异、低置信度变异以及与意义不明的克隆性造血相关的变异后,可以进一步提高TMB测定的准确性。

表5:DRAGEN Bio-IT平台大大缩短了数据分析的时间

数据分析步骤

DRAGEN解决方案

TruSight Oncology 500 ctDNA DRAGEN分析方案

BCL转换

6小时

1小时

比对 +

折叠 +

重新比对

170小时

11小时

融合检出

10小时

2小时

变异检出

24小时

8小时

总时间

~9

~20小时

结语

实验室可独立使用TruSight Oncology 500 ctDNA试剂盒,对血浆样本进行全景基因组分析。液体活检能够克服组织活检的限制(组织有限、肿瘤异质性),分析耐药性的生物标志物,并实现纵向监测。有了杂交捕获试剂和先进的工具来减少错误和增加测序深度,人们能够从检测限低(0.5% VAF)的样本中获得高质量的数据。

TruSight Oncology 500 ctDNA是一种基于NGS的多重检测,可在单次检测中分析数百个与癌症相关的生物标志物。该检测的内容与当前的指南和临床试验保持一致,能够从与多种癌症相关的523个基因中检测多种类型的变异,而无需使用多个样本反复检测。凭借广泛的基因组内容,TruSight Oncology 500 ctDNA还能评估免疫疗法的生物标志物(TMB和MSI)。现在就借助TruSight Oncology 500 ctDNA的力量来加快您的研究吧。

参考文献

1. Parikh AR, Leshchiner I, Elagina L, et al. Liquid versus tissue biopsy for detecting acquired resistance and tumor heterogeneity in gastrointestinal cancers. Nat Med. 2019;25(9):1415-1421.
2. Leighl NB, Page RD, Raymond VM, et al. Clinical Utility of Comprehensive Cell-free DNA Analysis to Identify Genomic Biomarkers in Patients with Newly Diagnosed Metastatic Non-small Cell Lung Cancer. Clin Cancer Res. 2019;25(15):4691-4700.
3. Stransky N, Cerami E, Schalm S, Kim JL, Lengauer C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 2014;5:4846. doi:10.1038/ncomms5846.
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5. Massard C, Michiels S, Ferté C, et al. High-Throughput Genomics and Clinical Outcome in Hard-to-Treat Advanced Cancers: Results of the MOSCATO 01 Trial. Cancer Discov. 2017;7(6):586-595.
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9. Parikh AR, Leshchiner I, Elagina L, et al. Liquid versus tissue biopsy for detecting acquired resistance and tumor heterogeneity in gastrointestinal cancers. Nat Med. 2019;25(9):1415-1421.
10. Leighl NB, Page RD, Raymond VM, et al. Clinical Utility of Comprehensive Cell-free DNA Analysis to Identify Genomic Biomarkers in Patients with Newly Diagnosed Metastatic Non-small Cell Lung Cancer. Clin Cancer Res. 2019;25(15):4691-4700.
11. Illumina (2017) TruSight Oncology UMI Reagents.(
www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/datasheets/trusight-oncology-umi-reagents-datasheet-1000000050425.pdf).

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