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Arraystar表观转录组芯片应用案例

——短暂局部性脑缺血显著改变小鼠大脑中RNA的m6A修饰水平

【字体: 时间:2019年12月11日 来源:康成生物

编辑推荐:

  近期,美国威斯康星大学(麦迪逊分校)Raghu Vemuganti教授实验室利用Arraystar mouse mRNA&lncRNA表观转录组芯片 ,首次发现在小鼠短暂局部性缺血12小时并再灌注后,122个mRNA和17个lncRNA的m6A修饰水平上升,15个mRNA和3个lncRNA的m6A修饰水平下降。

美国威斯康星大学(麦迪逊分校)Raghu Vemuganti教授长期从事ncRNA及脑损伤相关研究。近期,其实验室利用Arraystar mouse mRNA&lncRNA表观转录组芯片 ,首次发现在小鼠短暂局部性缺血12小时并再灌注后,122个mRNA和17个lncRNA的m6A修饰水平上升,15个mRNA和3个lncRNA的m6A修饰水平下降。通过GO/pathway分析发现m6A修饰水平变化的mRNA显著富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学过程。m6A修饰水平的变化可能是由去甲基化酶FTO表达下调引起。该研究成果于2019年8月发表在Stroke (IF: 6.046)。

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研究背景
缺血性脑卒中后神经元的命运由一系列复杂的生化和分子事件决定,包括兴奋性毒性、离子失衡、氧化应激、内质网应激、细胞凋亡和炎症等。缺血敏感性转录组的迅速改变可以促进这些过程的发生。此外,RNA的转录后水平调控可以精细调节缺血后病理生理变化,如非编码RNA、RNA结合蛋白和表观转录后修饰等。最近的研究表明,RNA上存在一百多种不同的化学修饰,可以在转录后水平调控RNA,其中m6A是含量最丰富的化学修饰,可以调控mRNA的剪接、运输、定位、翻译和降解。在哺乳动物细胞中,甲基转移酶METTL3、METTL14和WTAP催化m6A修饰的形成。而去甲基化酶FTO和ALKBH5介导去甲基化。而且FTO在脑中高度富集,其缺失导致多巴胺能神经元神经传递受损和先天性小头畸形。近期研究表明心肌缺血可导致控制心肌细胞收缩功能mRNA的m6A修饰水平上升。m6A修饰在哺乳动物脑中丰度最高,可以调控突触可塑性、轴突生长、学习记忆和应激反应。但m6A修饰缺血性脑损伤中的作用尚不清楚,为此文章作者检测了短暂局部性脑缺血对mRNA和lncRNA上m6A修饰的影响。

技术路线

结果展示

1. 预实验:dot blot证明短暂局部性缺血后m6A修饰总体水平升高。

为探究小鼠大脑短暂局部性缺血后,m6A修饰总体水平的变化,作者分别选取缺血3h、6h、12h和24h时雄性小鼠和对照小鼠大脑进行dot blot实验,发现12h和24h时,m6A水平明显上升。在雌性小鼠中,短暂缺血24h时,m6A水平显著上升。


图1. 小鼠大脑短暂局部缺血后m6A水平明显上升(雄性:12h和24h时,雌性:24h时)。

2. 高通量筛选:Arraystar mouse 表观转录组芯片证明短暂局部性缺血后显著改变特定RNA的m6A修饰水平。

确定短暂局部性缺血可导致RNA m6A总体水平显著升高后,作者利用MeRIP和Arraystar 表观转录组芯片,检测了短暂局部性缺血12h时小鼠大脑中mRNA和lncRNA的m6A修饰水平。芯片共检测到44122个mRNA转录本和12496个lncRNA转录本,其中127个mRNA和20个lncRNA的m6A水平发生显著变化。其中95% RNA(122个mRNA,17个lncRNA)的m6A修饰水平明显上升,只有5% RNA(5个mRNA,3个lncRNA)的m6A修饰水平下降。然后作者选取6个mRNA和2个lncRNA 分子,利用MeRIP-qPCR检测了m6A修饰水平的变化,结果与Arraystar表观转录组芯片结果相符。

 
图2. 短暂局部缺血后m6A修饰水平上升的mRNA及lncRNA明显多于修饰水平下降的RNA。


图3. 利用MeRIP-qPCR验证4个m6A修饰上升的RNA(A)和4个m6A修饰下降的RNA(B)。m6A的reader蛋白YTHDF1和YTHDF3在短暂缺血24h时表达上升(C)。

3. 生信分析:m6A修饰发生明显变化的RNA显著富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学过程。

为确定m6A修饰发生明显变化的mRNA的功能,作者进行了GO/pathway分析,发现相关mRNA显著富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学过程,细胞因子活性、蛋白酶结合、转录激活因子和转录抑制因子活性等分子功能,以及GPCR信号、细胞因子信号、肿瘤坏死因子(TNF)信号等KEGG通路,已有研究表明这些通路可以调控缺血性脑损伤。m6A修饰水平的变化可能影响了mRNA的翻译和lncRNA的功能,进而影响了脑缺血后细胞的命运。


图4. 对m6A修饰发生显著变化RNA的GO/pathway分析结果。

4. mRNA qPCR/WB:去甲基化酶FTO在短暂缺血后表达下调。

为确定m6A修饰水平上升的原因,作者分别检测了短暂缺血后m6A writer、reader和eraser的表达量,发现reader基因YTHDF1和YTHDF3只在缺血24h时表达上升,writer基因METTL3、METTL14和 WTAP的表达量不变,eraser基因FTO表达显著下降。免疫染色实验表明FTO主要在神经元中表达。说明m6A修饰水平的升高可能是由去甲基化酶FTO表达下调引起。


图5. 短暂缺血后FTO的mRNA(A)和蛋白(B)表达以及酶活性(C)均下降。


图6. FTO主要在神经元中表达。NeuN+是神经元细胞标志性蛋白,GFAP+是星形胶质细胞标志性蛋白,IBA1+是小胶质细胞标志性蛋白。

研究意义

该课题组借助Arraystar表观转录组芯片检测了小鼠短暂局部性脑缺血后mRNA和lncRNA上m6A修饰水平的变化。发现m6A修饰发生变化的RNA中大多数是修饰水平上升的,这些RNA显著富集到炎症、细胞凋亡和转录调控等生物学过程。m6A修饰水平的变化可能是由去甲基化酶FTO表达下调引起。该研究首次表明小鼠脑卒中明显改变RNA的m6A修饰水平,这可能对脑卒中后的病理生理学变化具有重要影响。

文章出处

Transient Focal Ischemia Significantly Alters the m6A Epitranscriptomic Tagging of RNAs in the Brain

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