无偏差预扩增试剂，助力低起始量样本研究！

【字体：大中小】 时间：2019年12月05日 来源：Takara

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　　Prelude™ PreAmp Master Mix（Code No.638541 & 638542）是一款用于cDNA或gDNA定向预扩增的2倍浓度的预混液。可从少量起始样本（10 pg of cDNA or gDNA）开始，高水平地实现100个以上靶序列的无偏差预扩增。

Takara的无偏差预扩增试剂，了解一下

Prelude™ PreAmp Master Mix（Code No.638541 & 638542）是一款用于cDNA或gDNA定向预扩增的2倍浓度的预混液。可从少量起始样本（10 pg of cDNA or gDNA）开始，高水平地实现100个以上靶序列的无偏差预扩增。

预扩增实验有助于增加特定下游靶序列的cDNA或gDNA的起始量，可以使用有限或低质量的珍贵样品（如FFPE、外泌体或液体活检）进行下游qPCR、SNP基因分型、靶向富集NGS等。

应用--预扩增实验

使用96-target cell cycle PrimerArray，分别对没有预扩增的100 pg cDNA以及进行了10个循环预扩增后的100 pg cDNA进行定量。结果显示，经过预扩增实验的所有靶序列，均可以通过荧光定量的方法有效检出。

预扩增实验面临的挑战和需求

当某些靶序列的PCR扩增效率较低时，可能会出现偏差，这可能会导致预扩增样本中靶序列的表达不足或过多。这些变化会影响下游分析产生的数据。

▪ 预扩增的异常值，可能会得到假阳性或假阴性
▪ 需求均一、无偏差扩增

成本也是一个主要因素；单个预扩增反应通常比标准PCR/qPCR反应贵10-25倍

需求：

▪ 无偏差预扩增，最好能扩增尽可能多个靶位点
▪ 对低起始量样本也能高灵敏度的扩增
▪ 与FFPE等主要临床样本类型兼容
▪ 性价比高

如何测量预扩增实验的偏差?

▪ 经过预扩增的低起始量cDNA和没有预扩增的高起始量cDNA 比较实验

10个循环预扩增的100 pg样本 = 20 ng没有预扩增的样本

10个循环预扩增的100 pg样本与14个循环预扩增的100 pg样本表达趋势相同

如何测量预扩增实验的偏差：通过两次实验得到的ΔCt值，计算ΔΔCt值后进行分析
▪ 10圈预扩增，通过目的基因与管家基因的比较获得第一个ΔCt值
▪ 14圈预扩增，通过目的基因与管家基因的比较获得第一个ΔCt值（或者对照样本）
▪ 如果没有引入偏差，应该有相对相似的比率（ ΔΔCt值在1.5范围内比较常见，0.75范围内更严谨）

比较10个和14个循环圈数的预扩增样本，所有96孔检测结果ΔΔCt值均在0.75范围内，说明使用本试剂进行预扩增的样本没有偏差。

灵敏度更高

我们的实验展示了样本起始量分别从12.5 pg- 50 pg- 100 pg，均能获得理想结果

同竞争公司相比，cDNA样本偏差更小

我们的异常值减少了5-20%，表明预扩增的偏差更小

同竞争公司相比，FFPE样本偏差更小

使用162-target breast cancer panel对FFPE样本进行检测

▪ 使用NucleoSpin提取FFPE中的total RNA，然后使用PrimeScript RT Master Mix进行反转录反应，之后进行14圈循环的预扩增
▪ 使用SmartChip TB Green Gene Expression Mix试剂，在SmartChip系统上对预扩增的cDNA样本进行反应

综上所述，Prelude™ PreAmp Master Mix可以对有限或低质量样本进行目标特异性预扩增，用于下游qPCR、SNP基因分型或TE NGS。

▪ 高灵敏度，最低10 pg起始样本
▪ 预扩增偏差性较小
▪ 成功使用162-target breast cancer panel对FFPE样本进行检测
▪ 预混型试剂，操作方便
▪ 性价比高

制品信息