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实验攻略丨CRISPR-Cas9基因编辑RNP体系实验操作及T7E1酶切效率筛选

【字体: 时间:2019年12月30日 来源:锐博生物

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  锐博生物riboEDIT™ CRISPR-Cas9 RNP(核糖核蛋白复合物)由化学合成的crRNA、tracrRNA及Cas9蛋白组成,化学合成crRNA和tracrRNA与Cas9蛋白混合后转染细胞,可快速实现靶基因的编辑。

基于Cas9 mRNA的全RNA体系和基于Cas9蛋白的RNP体系。由于无需繁琐的克隆构建,不再需要载体和慢病毒,准备工作少,低毒性,高效率,周期短,对哺乳动物细胞编辑效率高,脱靶低,无DNA组分,可实现一次多个crRNA指导下多靶点编辑,受到了越来越多客户的青睐!而如果您希望编辑干细胞、原代细胞或悬浮细胞等难转染细胞,则RNP体系是比较理想的选择。

什么是CRISPR-Cas9的RNP体系?

锐博生物riboEDIT™ CRISPR-Cas9 RNP(核糖核蛋白复合物)由化学合成的crRNA、tracrRNA及Cas9蛋白组成,化学合成crRNA和tracrRNA与Cas9蛋白混合后转染细胞,可快速实现靶基因的编辑。与传统Cas9/gRNA质粒转染相比,基因编辑效率更高,脱靶效应更低,且无DNA整合的风险,是更加理想的基因编辑系统。

一、 体系的运输保存

1. 低温运输

riboEDIT tracrRNA、riboEDIT crRNA、riboEDIT Cas9 Protein、riboEDIT T7EI Enzyme(液态储存)、riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set(阳性对照为冻干粉形式,上下游引物为液态存储)等组分为干冰运输。

2. 保存方式

-20℃低温冻存,避免反复冻融,长期请置于-80℃保存,实验过程置于冰上放置,使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。

二、 riboEDIT™ CRISPR-Cas9 RNP操作方法

1. 实验准备(以转染24孔板为例)

(1) 将riboEDIT™ tracrRNA(5nmol)和riboEDIT™ crRNA(5nmol)分别加入250μL RNase-free H2O,稀释至20μM,作为储存溶液。使用前,用RNase-free H2O进一步稀释至5μM,置于冰上备用。注:riboEDIT™ tracrRNA和riboEDIT™ crRNA可根据具体实验体系稀释至合适的浓度使用。
(2) riboEDIT™ Cas9 Protein (20μM)用Opti-MEM™减血清培养基或PBS稀释至6μM,置于冰上备用。

2. 实验步骤

(1)准备细胞:转染前18-24h,取对数生长期细胞接种于24孔板中,实验前细胞密度达到50%~70%为宜。
(2)取一支1.5mL EP管,加入25μL Opti-MEM™减血清培养基,然后加入1μL riboEDIT™ Cas9 Protein(6μM)。
(3)在以上EP管中再加入1.2μL tracrRNA(5μM)和1.2μL crRNA(5μM),crRNA和tracrRNA按1:1加入。
注:推荐crRNA:tracrRNA:Cas9 Protein使用比例1:1:1~5:5:1,最佳比例可按照表2自行优化。
(4)室温孵育10min,形成Cas9 RNP复合物。
(5)用25μL Opti-MEM™减血清培养基稀释3μL Lipofectamine 3000转染试剂。
(6)将Cas9 RNP复合物加入到转染试剂中,室温孵育15min。
(7)孵育结束后,将上述制备好的转染复合物加入到细胞培养基中,继续培养48~72h。
(8)提取基因组,使用riboEDIT™ T7EI Enzyme进行基因编辑效率检测。

表1. riboEDIT Cas9 RNP转染体系

* 转染体系需确保转染总量(pmol),pmol/μM=加入的体积
* 请保证crRNA和tracrRNA按1:1加入

riboEDIT™ CRISPR-Cas9 RNP的优势

从上面的操作步骤来看,相比于质粒载体表达Cas9和Cas9稳定表达细胞株或慢病毒,riboEDIT™ CRIPSR-Cas9的RNP体系的优势非常明显。主要总结如下:

(1)riboEDIT™ CRIPSR-Cas9的RNP体系相比质粒载体或Cas9稳定表达细胞株而言,Cas9蛋白为瞬时表达,脱靶效率低、无DNA整合风险和启动子兼容性问题,大大提高应用安全性。
(2)即用型体系,通过一步转染,5-6个工作日即可完成编辑效率检测,操作简便,显著缩短实验周期。
(3)RNP体系在转染12-24h后快速发生基因编辑,质粒载体一般需要72h。
(4)不需要自行构建载体或包装慢病毒,不需要病毒级的实验室环境。
(5)在大部分细胞中,比质粒表达载体具有更高的基因编辑效率。
(6)在大部分细胞中,可以通过转染多条crRNA对细胞中的多个靶点进行编辑,无需构建多靶点CRISPR表达载体,不引入多余的表达元件或因此导致的细胞毒性。

T7E1酶切检测靶位点编辑效率

1. 操作说明

在细胞转染后,建议使用T7E1酶切法筛选编辑效率高的crRNA进行下游实验。

2. 实验步骤

(1)提取基因组:细胞转染后48-72h后,收集细胞抽提基因组,并用微量紫外分光光度计定量。

(2)PCR扩增靶基因片段:将纯化得到的基因组DNA稀释至合适的浓度范围,吸取100ng-500ng基因组DNA用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,阳性对照组使用riboEDIT™ Positive Control crRNA Validation Set的引物进行扩增,引物信息见表2。

注:基因组DNA模板用量及PCR条件需根据反应体系自行优化。

表2. riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set 引物序列

(3)DNA片段退火:DNA片段按照表4退火体系进行混合,充分混匀后置于PCR中运行退火程序(表4)。或95℃加热5min,然后自然冷却至室温。

表3. 退火体系

表4. DNA双链退火程序

(4)T7EI酶切:退火完成后,每管加入0.5μL riboEDIT™ T7EI Enzyme(10U/μL),37℃温育30min。

(5)电泳检测: T7E1酶切后,产物进行纯化,然后使用2%-3%琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2200 Tape Station检测酶切条带和编辑效率。

高效率的基因编辑结果

采用MHCC97H细胞共转染6pmol riboEDIT™ crRNA, 6pmol riboEDIT™ tracrRNA和6pmol riboEDIT™ Cas9 Protein,48小时后riboEDIT™ T7EI Enzyme酶切检测靶位点的剪切效率,候选7个靶基因的剪切条带及编辑效率。


#1#2表示同一基因不同位点设计的2条crRNA
Indel%表示T7E1酶切检测的编辑效率

如图所示,针对7个目的基因分别设计2条crRNA,其中8条crRNA及其配套体系的编辑效率均达到50%以上,编辑效率最高的一条达到79.7%,这说明riboEDIT™ CRISPR-Cas9达到非常理想的编辑效率!

总而言之,riboEDIT™ CRISPR-Cas9即用型体系,无DNA组分,可大大简化前期实验准备与操作步骤,无需担心载体或慢病毒的表达元件或细胞毒性影响,更适合于高通量细胞水平的基因敲除和多靶点的筛选,以更简单的方式降低了基因编辑的操作门槛。

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