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捕获人BCR转录本完整V(D)J 可变区:SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit

【字体: 时间:2019年12月06日 来源:Takara

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  Takara Bio新推出的SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit基于5’RACE和NGS技术,提供了一种灵敏、准确、优化的BCR库分析方法。

众所周知,B细胞是适应性免疫应答的重要组成部分,其表面表达B细胞受体(BCR),可以识别病原体中的特定分子模式。

了解BCRs图谱(也就是由特定H,K,L基因片段构成的受体和克隆型多样性)不仅有助于深入了解健康个体中的适应性免疫应答,也有助于了解多种疾病的适应性免疫应答。准确鉴定免疫系统表达的克隆型和同种型有助于全面了解B细胞群体。

Takara Bio新推出的SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit基于5’RACE和NGS技术,提供了一种灵敏、准确、优化的BCR库分析方法。通过5’RACE方法减少了变异性,并且可以从BCR重链或轻链的恒定区引发扩增。该试剂盒将这些优点与基因特异性扩增相结合,可以捕获BCR完整V(D)J可变区,提供了一种高灵敏度、可重复的B细胞库分析方法。

下面就详细了解一下它的特点吧!

▪ 起始样品量:从外周血单核细胞(PBMC)纯化的10 ng-1μg的总RNA或从B细胞纯化的1-100 ng的总RNA
▪ 通过添加UMI,校正来自PCR错误、重复序列以及序列错误的读取
▪ cDNA文库构建经过优化,可以灵敏、特异地检测克隆型
▪ 可准确扩增并通过测序鉴别人IgG亚类
▪ 经过优化的PCR pooling策略,可以高灵敏度地从同一样品中检测不同链
▪ 灵活的pooling策略适用于不同的实验需求,以比对、识别原始链序列
▪ 可以使用Takara Bio Immune Profiler Software进行序列数据分析的完整工作流程


图1. SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit技术流程。

Panel A 第一链cDNA合成由dT引物(RT引物)起始,MMLV衍生的SMARTScribe反转录酶会在mRNA模板5’末端添加几个非模板核苷酸。SMART UMI Oligos与这几个非模板核苷酸互补结合作为模板,通过RT在第一链cDNA末端添加额外核苷酸序列(也就是模板转换步骤)。然后第一链cDNA经过两轮基因特异性的PCR扩增(详见Panel B)。第二轮的巢式PCR扩增可以确保绝大多数的reads比对到B细胞受体的转录本上。

Panel B. 第一轮PCR以第一链cDNA为模板,引物包括与Illumina Read Primer 2序列互补的正向引物(PCR1 Universal Forward primer),以及与BCR重链或轻链恒定区互补的反向引物(PCR1 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primers)。 以Read Primer 2序列和恒定区起始,第一轮PCR特异性扩增了BCR重链或轻链cDNA的完整可变区及部分恒定区。 第二轮PCR以第一轮PCR的产物为模板,采用半巢式引物(PCR2 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primers)扩增BCR重链或轻链的cDNA的完整可变区及部分恒定区。


图2. 从1-100 ng B细胞RNA中鉴定出的克隆型信号

从1 ng,10 ng和100 ng人CD19 + B细胞总RNA中,利用本试剂盒制备BCR分析IgG,IgM,IgK和IgL文库。 为了进行分析,对于1 ng,10 ng和100 ng的RNA起始,分别将文库down-sampling至100,000个,400,000个和5,000,000个reads,然后利用Takara Bio Immune Profiler Software处理。


图3. 散点图展示了用1μgPBMC RNA生成的文库之间的一致性

以来自健康供体的1μg PBMC RNA起始,一式两份制备IgG,IgM,IgK和IgL文库。 通过down-sampling至1300万次读取来分析该文库。该图包括来自技术重复的所有四个文库(IgG,IgM,IgK和IgL)。


图4. 来自不同供体的PBMC RNA的克隆型计数

对来自8个供体的10 ng PBMC RNA(不同颜色代表不同供体),分别使用SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit来鉴别IgG,IgM,IgK和IgL的克隆型。文库归一化为100,000 reads以进行分析。


图5. 10 ng PBMC RNA文库的测序饱和度评估

以来自单个供体的10 ng PBMC RNA起始,使用SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Kit制备BCR分析文库。 Panel A. 显示了不同测序深度的IgG克隆型计数,其中蓝线和紫线分别是指经过UMI修正误差和没有经过UMI修正误差的数据。IgG和其他链(IgM,IgK和IgL未在图中展示)按每个文库150万个读数进行测序,然后通过down-sampling至1,000K,500K,200K,100K,50K,10K和5K reads。 使用Takara Bio Immune Profiler Software分析不同测序深度的结果。Panel B维恩图显示了低测序深度(100K)和高测序深度(1,500K)的文库之间重叠的克隆型。

产品名称

包装量

Code NO.

SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit

12

634466

48

634467

欢迎索取SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit的详细资料

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