实时定量,你真的做对了吗?

【字体: 时间:2019年12月05日 来源:Tiosbio

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目前人类35%的遗传疾病或由RNA选择性剪接导致,如视网膜色素变性、脊髓性肌肉萎缩症等。

——施一公

生命体是一个多层次,多功能的复杂结构体系,转录组代表了基因表达的中间状态。基因功能的多组学分析过程中,实时定量PCR技术凭借其低廉的试验成本,被广泛应用于重要功能基因表达差异的验证。研究人员仅需下载GenBank中目的基因的参照mRNA序列,设计、合成一对基因特异性扩增引物和一对适宜的看家基因扩增引物,抽提总RNA,反转录,进行实时定量PCR扩增,通过比较试验组和对照组间基因表达的差异,就能确定试验处理对功能基因表达的影响。但是貌似非常成熟的试验体系真的能揭示特定功能基因转录组水平表达的真相吗?研究人员是否遗漏了某些可能影响其研究结论的生物学事件?

可变剪接(alternative splicing,AS,又称选择性剪接,是真核生物基因表达的普遍调节机制, 指功能基因通过不同剪接,从一个mRNA前体(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mRNA剪接异构体的过程。可变剪接可产生在非翻译区(UTR)或编码序列,其机制包括: 外显子跳跃(exon skip,ES)、内含子保留(retained intron,RI)、可变供体位点(Alternate Donor site,AD)、可变受体位点(Alternate acceptor site,AA)、可变启动子(Alternate promoter,AP)、可变终止子(Alternate terminator,AT)和外显子互斥(Mutually exclusive exons, ME)这七类。mRNA通过这七类可变剪接,对mRNA的稳定性、定位或翻译进行调控[1]。90%~95%的人类基因会经历选择性剪接[2,3]。20,000种人类蛋白质编码基因中有1/3以上的基因通过可变剪接产生多个蛋白亚型[4]。除了涉及器官发育,诱导细胞增殖、细胞分化,调节细胞类型特异性功能[5、6]外,可变剪接还与癌症[7]、药物靶点[8]等病理过程有关。

以磷酸酶和肌动蛋白调节因子1(PHACTR1)为例,2009年该基因就被确定与人冠状动脉疾病(CAD)有关[9]。借助RACE和实时定量PCR技术,Valérie-Anne等(2018)确定该基因存在6种蛋白亚型,包括单核细胞表达435 bp的短转录本(144 aa),大脑表达1743 bp的长转录本(580 aa),和外显子7、8或10、11可变剪接产生的A+(1953bp,650 aa)、B+(1674 bp,557 aa)、A-(1746 bp,581 aa)、B- (1467 bp,488 aa)4种适中长度的转录本。除短转录本与人免疫功能有关外,长转录本和冠状动脉内皮或血管平滑肌细胞内表达的4种适中长度转录本均涉及CAD。PHACTR1内含子的rs9349379位点可破坏MEF2的结合位点,调节A+、B+的表达,最终影响CAD[10]

另外,马的COBLL1基因存在COBLL1a和外显子9缺失的COBLL1b这两种可变剪接。COBLL1b缺失的外显子9编码40个氨基酸残基,包含了酪蛋白激酶1、p38丝裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶C的磷酸化位点,这些磷酸化位点与蛋白的稳定性密切相关。通过比较赛马多个组织的COBLL1的表达发现,多个组织的COBLL1b表达较为稳定;肾脏、脊髓、肺中COBLL1a的表达量最高,甲状腺和结肠中表达最低;纯种马运动后肌肉组织COBLL1a和COBLL1b的表达均发生下调。因此,COBLL1基因仅通过外显子9的有无就实现了同一基因在不同组织表达模式的精细调控,并最终影响赛马运动后的肌肉葡萄糖水平的调节或能量来源转换过程[11]

以上两个例子都说明了,通过可变剪接,同一基因可发挥不同的生物学功能。如果不了解目的基因的可变剪接情况,科研人员通过直接下载GanBank登录的参照基因mRNA序列,就设计功能基因的定量检测引物,来检测基因的表达情况,获得的很可能是不全面,甚至错误的信息。

对功能基因表达的正确分析,首先建立在研究人员对目的基因可变剪接的全面认识之上。首先,研究人员应该通过RACE技术或三代全长转录组测序技术,明确目的基因是否存在可变剪接。如果证实目的基因存在多种可变剪接后,应对不同可变剪接的序列进行比对和生物信息学分析,确认可变剪接的类型和不同可变剪接的特征区域,针对相应特征区域设计定量的检测引物,才能正确获取功能基因的表达情况。

Tiosbio聚焦RNA领域12年,基于对SMARTer技术和基因克隆技术的深刻理解,推出了世界首款区分动、植物和病毒样本的RACE cDNA合成试剂盒。Tiosbio™ SUPERSWITCH RACE cDNA Synthesis Kit通过自主知识产权的转录引物序列和优化转录反应Buffer,大幅提升了转录引物的跳转效率。该试剂盒既具备SMARTer试剂盒的独特优势,又避免了单一接头序列易导致非特异性扩增的缺陷。Tiosbio™ SUPERSWITCH RACE cDNA Synthesis Kit还提供了一套基因克隆的标准化试验流程,指导科研人员实现对功能基因的批量克隆,为科研人员对功能基因的转录水平研究提供了一把“金钥匙”。

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参考文献

[1]. Francisco EB, Jimena G. Alternative splicing as a regulator of development and tissue identity. Nat Rev Mol Cell Biol., 2017; 18(7): 437–451.
[2]. Pan Q, Shai O, Lee LJ, Frey BJ, Blencowe BJ. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat. Genet., 2008;40: 1413–1415.
[3]. Wang ET et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 2008; 456: 470–476.
[4]. Kim MS et al. A draft map of the human proteome. Nature,2014; 509: 575–581.
[5]. Norris AD, Calarco JA. Emerging roles of alternative pre-mRNA splicing regulation in neuronal development and function. Front. Neurosci.,2012; 6: 122.
[6] Vorlová S, Rocco G, Lefave CV, Jodelka FM, Hess K, Hastings ML, Henke E, Cartegni L.Induction of antagonistic soluble decoy receptor tyrosine kinases by intronic polyA activation. Mol. Cell, 2011;43: 927-939.
[7] Chabot B, Shkreta L. Defective control of pre-messenger RNA splicing in human disease. J. Cell Biol., 2016; 212:13-27.
[8] Sotillo E, Barrett DM, Black KL, et al.Convergence of acquired mutations and alternative splicing of CD19 enables resistance to CART-19 immunotherapy. Cancer Discov. 2015; 5:1282-1295.
[9] Kathiresan S, Voight BF, Purcell S, Musunuru K, Ardissino D, Mannucci PM, Anand S, Engert JC, Samani NJ, Schunkert H, et al. Genome-wide association of early-onset myocardial infarction with single nucleotide polymorphisms and copy number variants. Nat Genet. 2009; 41(3):334–341.
[10] Valérie-Anne CF, Mélissa B, Simon L, Ken SL, Guillaume L. PHACTR1 splicing isoforms and eQTLs in atherosclerosis-relevant human cells. BMC Med Genet. 2018; 19: 97.
[11] Park JW, Jang  HJ, Shin S, Cho HW, Choi JY, Kim NY, Lee HK, Do KT, Song KD, Cho BW. Molecular Analysis of Alternative Transcripts of the Equine Cordon-Bleu WH2 Repeat Protein-Like 1 (COBLL1) Gene. Asian-Australas J Anim Sci. 2015; 28(6): 870–875.

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