实时定量，你真的做对了吗？（二）

研究mRNA功能时，最常规的操作就是使用实时定量PCR分析功能基因的表达。研究人员仅需下载GenBank中目的基因的参照mRNA序列，设计、合成一对基因特异性扩增引物和一对适宜的看家基因扩增引物，抽提检测样品的总RNA，反转录，进行实时定量PCR扩增，通过比较试验组和对照组的基因表达情况，就能确定试验处理能否影响功能基因的表达。看似非常简便的操作真的能达到试验目的吗？答案是，你可能真的做错了！！！

因为，科研人员忽略了一个重要的试验环节——RACE。

cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法。实时定量PCR之前的RACE试验主要是为了①确定实验样本里的功能基因全长序列；②更为关键的，确定目的基因是否存在可变剪接(也称为选择性剪接，alternative splicing)，可变剪接的数量及相应序列。

大量的功能基因通过可变剪接编码不同的蛋白，同一基因的不同可变剪切甚至可以执行不同，甚至是完全相反的功能。

以上图为例，该基因如果存在E1~E4 4个外显子，在检测样品中该基因存在外显子跳跃所导致的可变剪接现象，对应序列分别为完整的蛋白，E4、E3和E2缺失的不同氨基酸编码产物。当基因特异性定量的引物设计区域位于区域1和3时，定量检测结果显示的是该基因4种可变剪接的总表达情况，不能分析不同可变剪接的各自的表达；当引物设计区域位于区域2 时，所设计的上、下游引物位于哪个外显子或是哪些外显子，将直接影响实时定量PCR的试验结果，并与区域1 和区域3的检测结果存在差异。

在实时定量PCR前，只有通过RACE技术获得目的序列的可变剪接序列信息，即是否存在可变剪接，并针对不同可变剪切体的差异区域设计相应的实时定量PCR检测引物，才能获得相应的可变剪接体的表达情况，确定试验处理对基因表达的影响。

那么，我们该如何选择RACE试剂盒呢?

我们推荐Tiosbio® SUPERSWITCH RACE cDNA合成试剂盒。该试剂盒使用了最经典的SMART技术，并做了如下优化：

1. 将5΄端跳转接头的合成方式从RNA转变为DNA。不仅降低了试剂盒运输和储存的难度，也使得试验体系更为稳定。
2. 两端接头引物从单一序列变为不同序列。避免因接头引物单引物自扩增，产生非特异性扩增产物的风险。
3. 引物体系按物种分为植物、动物和带poly A尾的病毒3种不同的试剂盒。
4. 通过调整转录Buffer，使得反转录酶的末端转移酶活性由末端加1~3个C，优化成末端加6~7个C，5΄跳转效率更为高效，更容易获得5΄端全长。

Tiosbio® SUPERSWITCH RACE cDNA合成试剂盒表现优异，能够实现高效和稳定基因全长克隆结果，使研究人员更容易获得功能基因的可变剪接。

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