“少年杀手”骨肉瘤的新细胞起源以及STK11/LKB1对骨癌的发病影响

中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所和中山大学肿瘤防治中心/肿瘤医学协同创新中心等机构的研究人员利用条件性敲除的成骨肿瘤小鼠模型，鉴定出骨膜源性Ctsk-Cre细胞是成骨肿瘤的起源细胞，并提出一个治疗成骨肿瘤的有希望的新靶点——LKB1-mTORC1途径。

　　

【背景】

成骨肿瘤（osteogenic tumor）是骨组织最常见的原发性肿瘤，包括良性骨形成肿瘤、骨瘤、成骨细胞瘤和恶性肿瘤（又称为成骨源性肉瘤或骨肉瘤）。骨肉瘤主要在儿童和青少年人群中高发，老年人位列第二发病率高峰。由于传统化疗生存效益不理想，因此预后较差，当前迫切需要更多针对性和个性化的治疗骨肉瘤的方法。

越来越多证据表明，小鼠模型可以概括人类骨肉瘤的基本方面，并提供靶向治疗目标。利用转基因小鼠或基因敲除小鼠模拟人类癌症已经被证明可以显著地加深我们对肿瘤形成的确切细胞来源以及信号通路的理解。

以往的研究表明，p53和/或Rb基因突变以及其他成员参与鼠模型和人类骨肉瘤患者起源，破坏间充质祖细胞（Prx1-cre）、成骨细胞前体细胞（Osx-Cre）和成骨细胞定向细胞（Col1a1-Cre和OCN-Cre）的p53/Rb，可以导致骨肉瘤，间接证明间充质起源和成骨谱系细胞对成骨肿瘤的形成负责，另外，定向成骨细胞（Col1a1-Cre）的NOTCH激活足以诱导骨肉瘤说明定向成骨细胞可能是成骨肿瘤的一个潜在来源。然而，对不同亚型的基因突变的确切细胞起源仍有待描述。

LKB1，由Stk11编码，主要通过mTORC1途径控制关联能量动态平衡和细胞生长的丝氨酸/苏氨酸激酶。缺失LKB1可引起增生和肿瘤。LKB1失活的癌症往往表现出侵袭性，对治疗的敏感性与LKB1未失活的癌症不同。LKB1可能与骨癌有关。最近的一项研究表明，41%骨肉瘤患者LKB1蛋白表达下降，大多数患者的mTORC1激活。虽然认为LKB1丢失与成骨肿瘤有关，但相关的细胞类型和潜在途径尚不清楚。

组织蛋白酶K（Cathepsin K，Ctsk）是一种由破骨细胞分泌的半胱氨酸蛋白酶，对骨吸收过程中的基质胶原的降解至关重要。Ctsk启动子仅对破骨细胞有活性，Ctsk-Cre小鼠被广泛用于破骨细胞功能研究，最近一项研究指出，当删除Ctsk-Cre细胞的Ptpn11，Ctsk-Cre可以是软骨细胞祖细胞，通过激活Hedgehog信号导致混合性软骨瘤病。删除软骨细胞Lkb1（Col2a1-Cre）导致骨骼生长板显著破坏以及软骨肿瘤形成，Ctsk-Cre细胞的Lkb1缺失可导致软骨肿瘤。

【方法和结果】

有趣的是，新研究发现，Ctsk-Cre细胞的Lkb1缺失导致了成骨源性肿瘤样表型，而并非软骨肿瘤。谱系追踪表明，Ctsk-Cre可标记为骨膜源性细胞群，根据标志和功能特性可定义为间充质祖细胞，换句话说，Ctsk-Cre细胞可以作为软骨肿瘤和成骨肿瘤在不同信号调节作用下的祖细胞。其中，mTORC1抑制剂具有治疗骨肉瘤的潜力。

这项研究发现了成骨肿瘤的一个新细胞起源，并指出Lkb1在原发性骨肿瘤中充当肿瘤抑制因子的角色，从而提高了我们对两种细胞的认识。成果发表在《The Journal of Clinical Investigation》（最新影响因子13.251），题为“Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation”。

1. Ctsk-Cre细胞的Lkb1缺陷可引起成骨肿瘤样肿瘤表型
 
为了调查Lkb1在Ctsk-Cre细胞中的作用，研究人员分别构建了Ctsk-Cre小鼠和Ctsk-CKO小鼠，缺乏Lkb1的软骨细胞系（Col2a1-Cre）。由于Ctsk-Cre细胞被认为是间软骨瘤（metachondroma）的来源，推测缺乏Lkb1的Ctsk⁺细胞会导致软骨癌。然而，令人惊奇的是，Ctsk-CKO小鼠并未表现出软骨癌，反而呈现出一种特殊的骨骼表型。KO鼠在13周龄以前表现为过度生长，13周后体重下降。85%的KO鼠死于30周龄前。

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Ctsk⁺细胞缺乏Lkb1，致密骨肿瘤样聚集，与细胞周期有关的基因（包括Ccnd1、Cdkn1a、Cdkn2a和Cdkn2b）显著增加，Ctsk-CKO小鼠骨肉瘤原癌基因Mdm2和Notch靶向基因Hey1表达升高，它们在骨肉瘤患者和小鼠模型中同样频繁上调。相反，Rb和Bub3等抑癌基因表达下调（图1）。

图1. Ctsk-Cre细胞的Lkb1缺陷可引起成骨肿瘤样肿瘤表型

 
之后，研究人员将Ctsk-CKO小鼠与对照小鼠（Ctsk-Ctrl）进行比较，定量微量 X射线断层扫描和RT-qPCR结果表明，致密骨厚度和异位骨形成增加，但骨体积和组织体积百分比下降，前成骨细胞标记Alp和Col1a1特异性增加，Ctsk-CKO小鼠骨形成激活，根据观察到的成骨细胞活性增加，肿瘤主要由成骨细胞组成（图2）。

图2. 敲除Ctsk-Cre细胞的Lkb1导致骨形成增加

2. 破骨细胞前体细胞的Lkb1缺陷不会诱导成骨肿瘤样表型
 
破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色发现，Ctsk-CKO小鼠的骨膜、骨内膜和松质骨的破骨细胞数量增加。研究人员还利用Ctsk-CKO和Ctsk-Ctrl小鼠的骨髓细胞分化为破骨细胞。TRAP活性定量显示，来自Ctsk-CKO骨髓细胞的破骨细胞形成增加（图3），说明Ctsk-CKO小鼠的骨量增加并非因为再吸收受损。其他实验排除了Ctsk-CKO小鼠的成骨肿瘤样表型与破骨细胞功能改变有关。

图3. 破骨细胞前体细胞缺失Lkb1不会造成成骨肿瘤样表型

3. Ctsk-Cre成骨间充质细胞是成骨肿瘤的潜在来源
 
细胞谱系追踪显示Ctsk-Cre阳性LysM-Cre阴性细胞群位于致密骨的骨膜内（图4）。随着年龄增长，Ctsk-CKO小鼠的Ctsk-Cre阳性细胞不断扩张填满了胫骨的致密骨。20周龄前，GFP阳性细胞形成胫骨Ctsk-CKO小鼠的骨样肿瘤，暗示成骨肿瘤来自LKB1缺失本身。

图4. Ctsk-Cre骨膜间充质干细胞是成骨肿瘤的新型潜在来源

接着研究人员分析了Ctsk⁺细胞的通用干细胞标记表达情况，发现Sca1、CD24、CD44、CD49f 和CD146都有表达。随后采用赛业生物（Cyagen）干细胞定向诱导技术，体外观察骨膜Ctsk⁺细胞的分化潜能，证明它们可以分化为成骨细胞和软骨细胞，以及表达相应的分化标志物。换句话说，Ctsk⁺可定义为一群间充质干细胞。

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4. LKB1抑制Ctsk⁺骨膜间充质干细胞的自我更新和成骨分化能力

鉴于Ctsk⁺骨膜间充质干细胞的角色，这项研究首次发现Lkb1可以抑制这些细胞的自我更新能力以及成骨分化能力。

为了验证，Lkb1缺陷是否足以驱动正常小鼠的成骨肿瘤形成。研究人员分别将对照小鼠和Ctsk-CKO的骨膜源性细胞进行裸鼠皮下注射移植。8周后，HE染色和共聚焦成像显示，Ctsk-CKO组骨样基质的细胞和核表现出肿瘤异型性和肿瘤形成特征。

随后，抑制mTORC1信号可以改善Ctsk-CKO小鼠肿瘤进展，并阻止异种移植模型的肿瘤生成。

 

【总结】

本研究证明了骨膜Ctsk⁺细胞的LKB1缺失导致成骨肿瘤样表型，介导途径为mTORC1的活动增加，澄清了Lkb1在人类骨肉瘤生成中的作用。此外，扩展了Ctsk⁺细胞的定义，即它们不仅是一类新型骨膜间充质祖细胞，而且还是骨肉瘤的来源。

骨髓瘤治疗可以靶向多条通路的联合疗法以期取得协同效应，例如，理论上采用雷帕霉素结合抗VEGF疗法，治疗LKB1损伤的骨肉瘤患者。LysM⁺细胞缺失Lkb1后不会导致致密骨肿瘤形成，说明破骨细胞没有参与Lkb1相关骨肉瘤发病机理。而实际上，Ctsk-CKO和LysM-CKO小鼠都表现出破骨细胞形成（图3），Ctsk-CKO小鼠富含大量破骨细胞和破骨细胞前体细胞，意味着Lkb1可能在破骨细胞生成方面起到一定作用，未来，研究人员准备进一步调查Lkb1影响破骨细胞生成的具体角色。

原文检索：Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation

（生物通：伍松）