心碎的生物狗!我的实验要重做竟然是因为“他”

【字体: 时间:2019年03月11日 来源:默克中国

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  在细胞培养过程中,真正困扰研究人员的是繁琐的胰蛋白酶冻融流程:解冻储存的胰蛋白酶、分装成单次使用量、冻存分装试剂、亚培养时再次解冻,这意味着科学家最需要的是在冰箱外能保持稳定、在广泛的实验室温度条件下仍具有活性的胰蛋白酶配方。

:最近实验不顺,啥都不顺怎么办
师兄(资深研究僧):慢慢来,熬一下就过去了,出去走走,看看蓝天
:有帮助,但是治标不治本啊
师兄(资深研究僧):你最近做了什么实验,有什么困扰?待我分析原因
:为什么我的胰蛋白酶都会变质?害的我这次蛋白实验又失败了
师兄(资深研究僧):选择不好,胰蛋白酶是容易不稳定啊,导致实验结果出不来,这可是你自己的问题。
:……
师姐(心理辅导师):论胰蛋白酶的重要性,来来,我给你科普下。

对科学家而言不仅是工具:论胰蛋白酶在实验室的重要性

生理学家认为,胰蛋白酶等丝氨酸蛋白酶是存在于消化液中稳定、关键的蛋白消化酶。最早关于胰蛋白酶的描述是在19世纪末期,胰蛋白酶最初作为胰蛋白酶原形成于胰腺,然后通过胰腺管到达十二指肠并剪切为活性形式。酶活性的封存可防止体蛋白的无选择、不合需求的剪切,避免引起炎症疾病如胰腺炎。


 图1:胰蛋白酶可用于多种生物技术应用,比如在细胞培养中解离贴壁培养细胞(左图),以及质谱应用中蛋白的消化(右图)。右图:大肠杆菌蛋白消化后进行SDS PAGE电泳,然后切出一个斑点进行胰蛋白酶消化用于MALDI分析。

具有贴壁表型的细胞培养物

胰蛋白酶是一个有力的特异分子工具,在生命科学家的手中实现精确的蛋白剪切。关于胰蛋白酶在细胞培养中的应用报告最早出现于50多年以前。在细胞培养中,与胰蛋白酶短期孵育可以剪切蛋白,将贴壁培养细胞从培养平面和其他细胞上解离下来,从而将细胞从培养瓶、培养皿和培养板上移除,构建单细胞悬液用于细胞计数、细胞传代和其他下游实验。

特定应用的胰蛋白酶:请更稳定一些

除了细胞培养,胰蛋白酶在生命科学领域还有很多其他用途。比如在蛋白质组学实验中,胰蛋白酶可将蛋白消化成多肽用于质谱分析。在此应用中,胰蛋白酶的特异性尤其有用,因为它断裂只是羧基在精氨酸或赖氨酸残基上的肽键。

然而,胰蛋白酶消化蛋白的异常活性有时也会给蛋白质组学研究带来一些问题。如果不采取稳定措施,胰蛋白酶最终会进行自我消化,这是大家最不希望看到的,因为自我裂解可能污染和混淆实验结果。为了稳定质谱应用的胰蛋白酶,减少自身消化碎片产生的峰,默克科学家们研发出了高纯的重组胰蛋白酶配方“SOLu-trypsin”(EMS0004),一款先进的蛋白质组学级别的胰蛋白酶。“SOLu-trypsin”胰蛋白酶经过改良后不会进行自我剪切,不会产生污染质谱结果的胰蛋白酶片段,这是蛋白质组学研究的福音。


图2:第一个活性自溶产品形式的猪α胰蛋白酶的晶体结构

细胞培养新福利:一款适用于常规解离的热稳定配方

要为细胞培养应用开发不自我剪切的热稳定性胰蛋白酶非常容易,为什么要为常规的细胞培养应用开发一款不同的稳定胰蛋白酶配方呢?在蛋白质组学研究中,避免使用可能污染质谱结果的添加剂来稳定胰蛋白酶是非常必要的,但对细胞培养来说,其面临的问题是不同的。但细胞培养过程中,真正困扰研究人员的是繁琐的胰蛋白酶冻融流程:解冻储存的胰蛋白酶、分装成单次使用量、冻存分装试剂、亚培养时再次解冻,这意味着科学家最需要的是在冰箱外能保持稳定、在广泛的实验室温度条件下仍具有活性的胰蛋白酶配方。

新配方StableCell™胰蛋白酶不仅在4°C条件下稳定,而且在室温条件下也是稳定的,甚至在37°C条件下仍能保持>90%的活性。StableCell™胰蛋白酶有3个不同的浓度(1x5x10x),可根据不同的细胞粘附强度进行优化。而且与其他室温解离试剂不同,这个新配方仍是猪胰腺胰蛋白酶,不需要在之前使用传统胰蛋白酶配方的培养系统中再次进行验证。


图3:标准胰蛋白酶和稳定的胰蛋白酶随时间变化的活性对比

让你的应用成为你的指南:为什么胰蛋白酶的配方不尽相同?

许多实验室可能不管其应用是什么,都直接购买最常用的胰蛋白酶配方:0.25%胰蛋白酶+EDTA,再加入酚红作为pH指示剂。尽管不是典型的解离大部分贴壁细胞的强大试剂,但当EDTA加入胰蛋白酶后提供了一种解离细胞的协同机制:EDTA结合移除细胞-表面以及细胞-细胞间的钙,螯合培养基中抑制胰蛋白酶活性的游离Ca2+,从而降低胰蛋白酶的使用浓度,避免高浓度胰蛋白酶或过度孵育对细胞的伤害。胰蛋白酶在pH 7-9 范围内具有最佳活性,因此配方中通常使用酚红作为pH指示剂。然而,有些特殊应用则需要选择不含EDTA或酚红的配方。

选择和使用技巧:生命科学应用的胰蛋白酶配方

为实现最佳的细胞解离效果,下述技巧可帮助选择正确的胰蛋白酶配方:

• 对于存在较高自身消化片段和污染物峰风险的蛋白质组学研究,通过分子改进(如重组配方)方法实现稳定的胰蛋白酶是最佳选择。
• 在常规细胞培养应用中使用热稳定性胰蛋白酶配方可避免繁琐的冻融分装流程,避免出现丢弃不小心落在冰箱外的标准胰蛋白酶而产生的浪费。
• 标准和热稳定性胰蛋白酶配方通常都具有不同的胰蛋白酶浓度,使用为你的细胞推荐的最低有效浓度。

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