NGS样品制备:来自五位专家的建议[心得点评]

【字体: 时间:2019年04月12日 来源:生物通

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  对于新一代测序(NGS)而言,样品制备的重要性不言而喻。每次测序的成本可不低,若样品制备得不好,则实验就会彻底糊掉。在此,五位专家就如何改善NGS的样品制备过程,提出了他们的宝贵建议。

对于新一代测序(NGS)而言,样品制备的重要性不言而喻。每次测序的成本可不低,若样品制备得不好,则实验就会彻底糊掉。在此,五位专家就如何改善NGS的样品制备过程,提出了他们的宝贵建议。

欧洲分子生物学实验室(EMBL)的技术人员Ferris Jung:

你需要密切留意起始材料的质量。无论样品制备的过程有多完美,产物的质量都不会比起始材料更好。此外,你需要确保各项参数在文库制备试剂盒的参数范围内。即使高于或低于建议的参数,大多数试剂盒仍然可用,但这类实验要想获得成功还是有点困难。最后,为了区分异常值,你最好将实验重复三次或以上。

Promega的高级战略组合经理Kurtis Knox:

核酸质量比以往更重要。在选择纯化方法时,你需要考虑它是否能产生大量的DNA或RNA,而且生成的产物是否切实可用。花点时间和精力去进行质控和定量,尽量避免测序浪费或结果不佳。

PacBio的产品管理总监Paul Kotturi:

在使用长读长技术时,样品制备是一个重要的环节。许多方法侧重于简化流程和减少样品量,不过关键在于:

▪ 准确判定起始样品和最终文库的质量和大小分布。对于起始样本,你必须了解dsDNA的数量和大小分布,以确保你有足够的DNA来完成实验,并且这些DNA足够长。同样,对于最终生成的文库,你也要检测相同的指标。如果测量不准确,你加入的测序聚合酶可能过多或过少。前者会导致背景信号增加,而后者会导致加样过低。
▪ 将你的实验设计拿出来与经验丰富的专家讨论一下。长读长技术及相关技术一直在进步和演变。听取gDNA提取和定量、片段长度测定和长度筛选方面的建议,将帮助你获得更多信息。

安捷伦的高级营销总监Viresh Patel博士:

根据你的需求选择合适的文库制备试剂盒。需要考虑的因素包括应用、样品类型、DNA起始量、测序平台等。

▪ 对于材料有限的样品,如针尖穿刺或液体活检,你需要选择对DNA起始量要求低但转化效率高的产品。
▪ DNA浓度、DNA质量、DNA可扩增量、DNA片段长度分布等质控指标很重要,可确保结果准确,失败率低。
▪ 如果你有一台大容量的测序仪,那么你可以选择为样品添加序列标签(index)的文库制备方案,这样每次可运行更多的样品。
▪ 如果你需要检测极低频率的突变,那么你可以选择具有错误校正能力的样品制备方案。
▪ 最后,在选择文库制备试剂盒时,还需要考虑机械法 vs. 酶法DNA片段化、是否兼容FFPE、手动操作时间、整体周转时间以及试剂成本等因素。

Sage Science的营销副总裁Alex Vira:

NGS文库制备的最重要环节是确定起始DNA的质量和完整性,并了解文库构建过程的步骤,知道如何针对测序效率或分析类型来优化。

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