彩虹般的动物：Brainbow及各种衍生技术

在神经科学和发育生物学中，随机多色标记是一种常用的技术。这种技术是构建出含多色荧光蛋白（XFP）的重组载体，并利用它来标记器官或生物体。如今，随机多色标记技术正在多项研究中大放异彩。

在神经科学和发育生物学中，随机多色标记是一种常用的技术。这种技术是构建出含多色荧光蛋白（XFP）的重组载体，并利用它来标记器官或生物体。通过载体上的随机重组，细胞呈现出一种独特的颜色，并且后代都保留这种颜色。这样一来，科学家就能够追踪细胞群体的命运。如今，随机多色标记技术正在多项研究中大放异彩。

Brainbow：让大脑变成彩虹色

哈佛大学的Jeff W. Lichtman研究小组在2007年开发出这项技术的初始版本，并在《Nature》杂志上发表成果。他们用它来标记小鼠小脑中的神经元，因此将其命名为Brainbow。Brainbow 1.0版使用红色荧光蛋白（RFP）、黄色荧光蛋白（YFP）和青色荧光蛋白（CFP）。Brainbow 1.1版则加入了橙色荧光蛋白（OFP）。

Brainbow利用Cre/lox系统来标记神经元。编码荧光蛋白的基因与单个启动子串联在一起，但只有紧挨着启动子的基因能够表达。在Brainbow 1.0版和1.1版中，紧挨着启动子的分别是RFP和OFP，因此细胞在默认情况下发出红色或橙色荧光，直到重组发生。Cre介导的重组允许下游的其他基因表达，让大脑神经元如彩虹般绚烂。

之后，研究人员对Brainbow 1.0版不断进行改进，开发出更高级的版本。这些新系统在荧光蛋白的数量、稳定性和亮度方面有所改进。

Brainbow 2.0版便是其中之一，它利用Cre瞬时重组来实现两个基因的反转。另一个版本Brainbow 2.1则反转两组基因，并删除一组基因。因此，Brainbow 2.0版可作为RFP（默认）和CFP之间的开关，而Brainbow 2.1版可在GFP（默认）与RFP、CFP或YFP之间随意切换。

2013年，同一个研究团队在《Nature Methods》杂志上报告了升级版的Brainbow。Brainbow 3.0版采用了光稳定的荧光基团mOrange2、EGFP和mKate2（红色），以解决早期版本中Brainbow荧光强度低的问题。

在此之上，他们又开发出与众不同的Brainbow 3.1和3.2版本。在默认情况下，它们不发出荧光。研究人员在重组载体中插入了一段截短的YFP，只有当重组发生，切除不发荧光的YFP之后，才能激活下游OFP、GFP或RFP的荧光。未经历重组的细胞可通过截短YFP的免疫染色检测到。

对于Thy1-Brainbow小鼠，一些神经元可表达多达16个拷贝的转基因，而每个拷贝在重组后激活不同荧光蛋白的表达。这样，每个细胞都呈现出独一无二的色彩。在整个生命周期中，单个细胞的颜色都保持不变，甚至包括长度达100 μm的轴突。

Brainbow系统的不足在于它使用了并非普遍存在的启动子，这就意味着并不是所有的细胞都能被标记。尽管多个拷贝的转基因可整合到细胞中，但这些XFP的表达水平也不一定很强。为了解决这些问题，研究人员又开发出类似的系统，来改善大脑的多色标记。

果蝇的神经元标记

以Brainbow 1.0系统为基础，霍华德•休斯医学研究所的Julie Simpson等人在成神经细胞阶段对果蝇神经元进行了标记，这意味着相同谱系的神经元将在成年果蝇中表达相同的XFP转基因。由于终止表达框紧挨着荧光蛋白基因的上游，因此必须发生Cre重组才能出现荧光。此外，Cre重组酶还可以与现有的果蝇研究工具（如Flp重组酶）一起使用。

与此同时，英国医学研究理事会（MRC）国家医学研究所的Iris Salecker等人基于Brainbow 2.0系统开发出适用于果蝇的Flybow。Flybow采用的是Flp重组酶，而不是Cre重组酶。此系统中的XFP是系在膜上的，故特别适合细胞伸展的观察，比如果蝇视觉系统中的神经元，这在以往是很难研究的。

斑马鱼的细胞追踪

此外，研究人员也将Brainbow技术应用于斑马鱼。他们将Brainbow放在神经特异性启动子的下游，对神经元进行追踪，或者在单细胞阶段注射Brainbow，对整条鱼进行标记。

2013年，哈佛大学研究团队再次开发出Zebrabow（zebrafish brainbow）工具，用于斑马鱼的活体多色成像。Zebrabow是一组转基因斑马鱼，能够对整个生物体或特定的组织进行多色标记。通过Cre蛋白显微注射，或者将Zebrabow动物与诱导型Cre品系杂交，可在斑马鱼的发育过程中诱导重组。这种工具为斑马鱼的谱系分析提供了资源。

彩虹般的小鼠

对于哺乳动物体系，荷兰的研究人员在2010年开发出Confetti小鼠，当时结果发表在《Cell》杂志上。这是一种报告小鼠，在与表达Cre等位基因的小鼠杂交时，可以用于细胞的追踪。

Confetti 小鼠包含Brainbow 2.1载体，只有当重组事件发生后才表达XFP。组织特异性的Cre重组导致细胞随机表达细胞核GFP、细胞膜CFP、细胞质YFP或细胞质RFP。利用Confetti小鼠，研究人员第一次描绘出肠隐窝内的细胞自我更新。他们认为这是一种研究细胞增殖的有力工具。

两年后，法国马赛吕米尼免疫中心（CIML）的研究人员以Brainbow 1.0-L载体为骨架，开发出另一种转基因小鼠Ubow。在他莫昔芬（tamoxifen）诱导后，小鼠体内表达Cre的每个细胞只发生一次重组事件，使得每个拷贝表达YFP或CFP，而不表达Cre的细胞表达默认的RFP。

他们随后利用Ubow构建体来追踪朗格汉斯细胞的命运。在Ubow小鼠中，表达YFP、CFP和RFP的细胞存在的频率并不相同。利用CFP++细胞群体，他们能够纵向地绘制真皮中朗格汉斯细胞的更新，并确定朗格汉斯细胞是通过特定细胞的增殖而补充的。

新技术层出不穷

2018年，日本研究人员开发出最新的Tetbow系统，它通过引入Tet-Off系统来增强XFP的表达，从而克服了Brainbow中XFP表达量低的问题。Tetbow的亮度增强使得人们能够在多个视野内追踪长达数毫米的神经元，而Brainbow技术只能区分单个视野内的神经元。Tetbow可通过质粒的电穿孔或腺相关病毒载体引入体内。

这个实验室还开发出另一个版本的Tetbow。它利用化学标签来取代XFP，适用于组织透明化（tissue clearing）。这种方法是让组织（比如大脑）变得透明，这样就能看到荧光神经元的3D结构。化学标签更加耐受组织透明化方法，并且能标记更稳定的合成荧光基团。

此外，美国奥本大学的Fernando Biase将细胞谱系追踪方法与单细胞测序相结合，来研究早期发育阶段的分化。他在去年9月发表了这种称为Rainbow-seq的方法。

Rainbow-seq是基于哈佛大学开发的Brainbow载体，它含有四种不同的荧光蛋白基因，可整合到细胞的基因组。经过处理后，细胞发出荧光，便于分裂时的追踪。将此方法与Smart-Seq2相结合，Biase追踪到哪个细胞发育成囊胚的哪个部分，然后寻找基因表达的相应变化。

结语

如今凭借随机多色标记系统，科学家能够比以往更详细地观察到各种生物体的单细胞动态。随着新技术的不断开发，人们有望用上更新颖、更稳定的荧光基团，并与新的成像技术相结合。（生物通 薄荷）

相关文献

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Cai, Dawen, et al. "Improved tools for the Brainbow toolbox." Nature methods 10.6 (2013): 540.
Ghigo, Clément, et al. "Multicolor fate mapping of Langerhans cell homeostasis." Journal of Experimental Medicine 210.9 (2013): 1657-1664.
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