纳米孔测序技术在腺病毒疫情中实时检测应用研究

　　

新发急性呼吸道传染病不断出现，严重危害公共卫生安全，如何快速确认致病病原尤为重要。随着高通量测序技术的普及，基于宏基因组方法进行病原快速鉴定日益受到重视。但二代测序技术平台的测序周期长、设备难以移动等因素，极大限制了其在临床诊断及疫情现场实时检测方面的应用。目前商品化三代测序技术分为单分子实时（SMRT）测序和纳米孔测序。其中MinION（Oxford Nanopore Technologies）是第一台商品化纳米孔测序仪，体积小重量轻，建库简单，同时实时分析测序数据，可用于临床诊断、疫情暴发病原检测。

中国人民解放军疾病预防控制中心宋宏彬课题组最新报道了纳米孔测序技术在2019年2月河北一起腺病毒疫情检测中的应用情况，并对不同样本处理结果进行描述和分析。

这一研究发现公布在《国际病毒学杂志》上，《国际病毒学杂志》由中华医学会和北京市疾病预防控制中心联合主办，入选中国科学技术信息研究所中国科技论文统计源期刊（中国科技核心期刊）。是专业刊载病毒学基础、临床、药物、疫苗、防控等的综合性专业学术期刊。

MinION测序检测对样本中病原的核酸相对含量要求较高，快速建库要求起始样本平均浓度达到50ng/μL，目前多数研究采用培养后样本或进行PCR扩增富集后进行实时测序。但针对疫情样本直接进行快速检测，尤其是低浓度临床样本感染病原体实时检测鲜有报道。

腺病毒是一种常见的急性呼吸道感染原体，常在军营和学校暴发流行，我国暴发疫情多以7型腺病毒为主。北京及周边地区也先后报道了多起腺病毒疫情，但以3型腺病毒为主。

在这篇文章中，研究人员结合2019年2月河北某学校暴发的一起7型腺病毒疫情检测，采用重症、轻症混合富集后样本进行纳米孔测序，然后结合实时荧光PCR检测结果，选择Ct值较低的单个阳性样本进行直接测序，两者均在较短的时间内检测到7型腺病毒序列，并获得全基因组序列，评估了两种不同样本处理方案结果，为进一步探索MinION在疫情病原体检测中应用提供了参考。

研究显示，M32（轻症和重症混合样本）腺病毒序列平均读长为4480bp，最大读长为27895bp，S179（Ct值最低的病例样本）的腺病毒序列平均读长为3451bp，最大读长则为17510bp。采用基于参考序列的组装方法，最终得到M32腺病毒序列长度为35215bp，平均覆盖深度为19.1；而S179序列长度为35020bp，平均覆盖深度为10.5，与前者相比在基因组两端200bp缺少相关测序reads覆盖，无法获得完整的基因组序列。系统发育分析结果表明M32、S179与北京地区报道一株7型腺病毒BJ/CHN/2018（GenBank序列号为MH355567.1）位于同一分支，表明其可能具有共同的遗传来源。

样本M32和S179腺病毒测序序列读长分布

M32、S179腺病毒全基因组系统发育分析

研究人员指出，样本核酸浓度对于数据量的产出非常重要，核酸浓度低将影响测序数据产出量，造成测序通量浪费，给后续基因组组装、变异分析等造成困难，但对结果可靠性没有影响。S179样本浓度远低于MinION快速建库试剂盒要求的上样浓度（50ng/uL），仍能快速检测到腺病毒并获得近乎完整地全基因组序列，但其数据量仅为14.2M，对参考基因组的覆盖范围和深度均相对较差。通常认为重症病例样本核酸浓度更高，但此次疫情检测发现，重症病例核酸浓度远低于轻症病例核酸浓度，且实时荧光检测的Ct值也高于轻症病例，可能与样本采集过程以及病例是否处于感染急性期等因素有关。考虑到疫情暴发病例主要由同一病原感染，建议采用多样本混合富集方法，降低上述因素影响，提高测序数据产量，便于后续生物信息分析。

研究人员建议，针对未知病原高通量检测，需要同时进行RNA和DNA测序。通过将RNA反转录为cDNA，然后和DNA进行混合建库或分别建库测序，从而获得全面的病原核酸序列信息。对于MinION来说，反转录后的cDNA片段较短，混合建库数据产量较低，综合考量成本和测序时效性，此次疫情中只针对DNA进行建库测序和后续分析，重点关注纳米孔测序技术在不同处理方式下样本的实时检测结果。

虽然最新的研究实现了对流感病毒RNA直接测序，无需反转录为cDNA。但该方法仍受到诸多限制，随着纳米孔技术的迅速发展和后续研究的改进，将进一步拓展MinION在新突发传染病病原实时快速检测方面的应用空间。

研究证明，与二代测序技术平台相比，基于纳米孔测序技术的MinION测序仪在Reads读长、便携性、测序时效性方面具有显著优势。这项研究采用MinION对一起腺病毒疫情样本直接测序，分别对混合样本富集和单个样本进行实时测序分析，最快在14分钟内检测到7型腺病毒，并获得腺病毒全基因组序列。结果表明单个样本和混合样本均可以实现腺病毒检测，在进行PCR等传统分子生物学检测的同时结合纳米孔实时测序技术，可以实现病原的实时鉴定和分析，为今后新突发传染病病原的快速识别和确认提供了依据和参考。

原文检索：

纳米孔测序技术在腺病毒疫情中实时检测应用研究，国际病毒学杂志 2019 年 4 月第 26 卷第 2 期　International Journal of Virology, April 2019, Vol. 26, No. 2