数字PCR中模板制备——Gene-π课堂之三

【字体: 时间:2019年05月17日 来源:深蓝云生物

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  令人痛心的是,因为核酸提纯、保存等问题,多少珍贵的生物样本被损失,多少宝贵的研究时间被白白浪费!因而模板制备是数字PCR实验成功的关键步骤。模板提取,质量控制,保存都是其质控的重要因素。

上一讲我们给大家介绍了数字PCR引物探针的设计,今天给大家讲一讲数字PCR中模板制备。核酸与蛋白质(DNA & RNA & protein)是现代分子生物学研究的起始材料,因此控制样本核酸的质量是一切研究成功的根本。令人痛心的是,因为核酸提纯、保存等问题,多少珍贵的生物样本被损失,多少宝贵的研究时间被白白浪费!因而模板制备是数字PCR实验成功的关键步骤。模板提取,质量控制,保存都是其质控的重要因素。详细信息可登陆网站或扫描二维码查看。

    

模板提取

据报道,数字PCR与实验室中各种提取DNA和RNA模板的方法兼容,包括苯酚氯仿法,各种试剂盒提取方法。

质量控制

为了获得最佳的数字PCR性能,应该检查模板的纯度和质量。使用相关的方法,如分光光度法,能够验证提取的DNA溶液的良好吸光度(A260/230和A230/260)的比例。应避免污染物和/或潜在抑制剂的存在。

保存

提取的DNA模板的存储也是一个重要的监控因素。事实上,需要避免核酸降解,如胞嘧啶脱氨和8-Oxo-2 ' -脱氧鸟苷的形成,因为氧化损伤,可能导致在PCR扩增过程中的碱基转位。

缓冲液和温度条件对样品的质量也有影响,一般提取的DNA模板用TE溶解并-20℃保存。

样本本身固有的其他参数可能会对数字PCR实验产生影响:

1. 富含GC的模板

如果模板包含一个富含GC的区域,因为GC键非常稳定,这可能导致模板不能完全扩增。因此,为了使模板获得更好的变性,可以尝试在PCR混合物中添加DMSO或甜菜碱。

2. 高分子量DNA

一些制造商把高分子量的DNA或质粒作为影响分区的问题。建议在进行数字PCR之前使用化学或酶切方法进行DNA剪切,而且剪切步骤可以直接在PCR mix中进行。

3. DNA拷贝数测转换

在开始数字PCR检测之前,必须进行:DNA拷贝数测转换,如果是qPCR的用户,可能已经习惯了考虑DNA的量。在数字PCR中,需要根据反应中基因或基因组的拷贝数来考虑。为了计算拷贝数,唯一需要知道的是被研究基因组的质量,然后简单地应用这个公式:反应体积中拷贝数=反应体积DNA质量(ng)/研究基因组质量(ng)

参考文献

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