CRISPR vs. RNAi,功能基因组筛选哪家强?[选购宝典]

【字体: 时间:2019年05月24日 来源:生物通

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  过去十几年,RNAi一直是功能基因组学筛选的首选方法,但横空出世的CRISPR-Cas9似乎抢了RNAi的不少风头。在这里,我们就来比较一下RNAi和CRISPR-Cas9在筛选基因功能上的应用。

随着新一代测序的出现,各种生物的遗传数据呈指数级增长,但了解基因的序列数据,这显然还不够。为了让遗传数据真正派上用场,必须确定基因功能,并了解基因型与表型之间的关联。功能基因组学就旨在阐明基因型与表型之间的关系。

经典的方法是正向遗传筛选,也就是对基因功能进行修饰,并确定表型的变化。过去,正向筛选主要是依靠随机突变和病毒转座子来改变基因功能,但这些方法难以大规模开展。RNAi的出现让研究人员能够对基因功能开展靶向破坏。

过去十几年,RNAi一直是功能基因组学筛选的首选方法,但横空出世的CRISPR-Cas9似乎抢了RNAi的不少风头。在这里,我们就来比较一下RNAi和CRISPR-Cas9在筛选基因功能上的应用。

RNAi带来的基因沉默

人们早就观察到将双链RNA(dsRNA)引入生物体会引起基因沉默,但直到1998年Fire和Mello发表线虫的研究成果,这个机制才变得清晰,也有了RNA干扰(RNAi)这个术语。RNAi通过小分子RNA来调控基因表达,在细胞发育和免疫中起重要作用。

双链RNA分子在内源蛋白DICER和RISC的加工下成为单链RNA,靶向与其互补的mRNA转录本并使其降解,导致转录后的蛋白质水平降低。除了外源RNA,其他RNA分子也可以引发基因沉默,包括siRNA、miRNA和shRNA。

之后,RNAi被迅速用于各种细胞和生物体,一跃成为基因改造的首选方法。它仅需要短的干扰RNA(siRNA),就能引发基因功能的快速丧失。不过,利用siRNA来进行全基因组筛选就比较麻烦,需要一个一个来评估。

于是,人们利用慢病毒载体将shRNA文库导入细胞。shRNA随机整合到基因组中,并稳定表达,从而克服了siRNA的限制。这种方法让每个细胞带上“条形码”,实现了混合形式的全基因组shRNA文库筛选。它后来也应用到CRISPR-Cas9筛选中。

CRISPR-Cas9需要将Cas9和sgRNA一起导入,而RNAi的机制在大多数哺乳动物细胞中是保守的,这是它的主要优点。转染siRNA仍然是最快速最简单的方法,能够迅速引起表型变化。不过对于高通量的表型筛选而言,混合文库更有吸引力,并且更经济。

恼人的脱靶效应

RNAi和CRISPR-Cas9都有脱靶效应的风险,可能导致假阳性,因为shRNA或sgRNA可靶向带有互补种子区的序列,造成依赖序列的脱靶效应。RNAi同时还表现出不依赖序列的脱靶活性,导致干扰素调节基因的上调和蛋白质表达的改变。脱靶造成的基因沉默使人们很难鉴定和验证hits,对功能基因组筛选是不利的。

为了避免RNAi的序列依赖性脱靶效应,人们通过生物信息学工具来精心挑选shRNA序列,并采用多个独立的shRNA来靶向同一基因,以此来提高统计学显著性。目前,基于RNAi的正向筛选已经获得了可靠的数据集,但负向筛选仍受到高背景噪音的干扰。

在CRISPR-Cas9技术的早期也观察到序列依赖性脱靶活性,以及sgRNA效率的差异。不过,设计工具的改进在很大程度上减轻了这些的影响。如今,你可以借助多种算法来选择最高效、最特异的向导RNA库。与shRNA一样,选择多个sgRNA来靶向目的基因,可确认结果具有统计学意义。不过最近的一项研究表明,CRISPR-Cas9的脱靶效应要低于RNAi。

knockdown vs. knockout

RNAi和CRISPR-Cas9之间的主要区别在于RNAi是通过靶向RNA,在转录后水平降低或敲低基因表达;CRISPR-Cas9则是一种基因编辑工具,靶向DNA并永久改变或敲除基因表达。这两个选项都很有用,具体要取决于实验设计和待解决的问题。

某些情况下可能需要CRISPR-Cas9来完全敲除,以免残留的低水平蛋白表达造成任何不确定的影响。对于具有多个基因拷贝的癌细胞系,它就很有用。当然,在某些情况下敲低是更好的选择。例如,必需基因的敲除是致死的,导致细胞难以研究。敲低则可以更好地模拟药物对靶点的抑制。

随着CRISPR-Cas9工具箱的扩大,人们的选择不仅仅限于CRISPR-Cas9和RNAi。将催化失活的Cas9(dCas9)与转录抑制因子相连接,现在也可以实现CRISPR介导的敲低。CRISPR干扰筛选(CRISPRi)将RNAi的敲低功能与CRISPR的高效特异相结合,应用于功能基因组筛选。

shRNA vs. sgRNA

CRISPR-Cas9技术的快速发展,递送载体和sgRNA设计的改进,以及CRISPR衍生技术的出现(包括CRISPRi、CRISPRa、碱基编辑、表观基因组编辑)将人们从RNAi中吸引过来。CRISPR基因敲除的效率以及高特异性和低背景,与RNAi形成了鲜明对比。RNAi的优势在于依靠内源性RNA沉默机制,因此在操作上是最简单的方法。

如今,多功能的CRISPR技术让一系列的基因修饰(CRISPR-KO、CRISPRi和CRISPRa)得以实现。因此,它已取代RNAi成为首选的功能基因组筛选工具。

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