【用户谈】利用纳米孔测序组装完整的X染色体

Oxford Nanopore公司日前在伦敦举办了盛大的London Calling 2019用户会议。来自世界各地的600名与会者聚集在Old Billingsgate，讨论纳米孔测序的方方面面。据悉，87名科学家将会发表演讲，介绍纳米孔测序的各种应用。

第二天，加州大学圣克鲁兹分校的Karen Miga介绍了如何利用纳米孔测序来组装完整的人类X染色体。

Karen在开场时表示，我们正在进入遗传学和基因组学的新时代，需要高质量的完整组装。现有的人类参考基因组（GRCh38）是迄今为止最准确且完整的脊椎动物基因组，但它并不是完整的，还有368个未解决的问题和102个缺口。

以21号染色体为例，它有~30 Mb的组装序列，但缺失了~20 Mb的序列，这些区域可能与疾病相关联。它们代表了与片段重复、基因家族、卫星序列、着丝粒和rDNA相关的区域。为了打造完整的人类基因组，Telomere-to-Telomere（T2T）联盟成立，而Karen正是其中的一员。

Karen及其同事利用长读长的纳米孔测序技术对CHM13hTERT细胞系进行测序，这是一种核型稳定的单倍体细胞系。从2018年5月到2019年1月，她们共使用了94张MinION/ GridION芯片来测序，获得了50倍的覆盖深度，映射后最长读长达1.04 Mb。

她们利用这些超长的纳米孔数据来构建重叠群，并结合其他测序平台的长读长数据集来精细处理和结构验证。之后利用比对软件Canu进行序列组装；最终组装好的序列为2.94 Gb，N50重叠群为75 Mb，这在完整性和连续性上超过了N50重叠群为56 Mb的GRCh38参考基因组。

Karen表示，下一步将利用这种混合的从头组装方法来组装完整的X染色体。X染色体与许多孟德尔疾病相关，因此值得投入时间进行研究。最大的挑战在于着丝粒，它需要能够跨越100 kb高度重复区域的超长纳米孔序列。不过，她也认为手动完成的组装还需要使用其他方法来验证。

为了处理串联重复，Karen等人利用独特的k-mers来进行polish。首先包括识别整个基因组中所有独特的单拷贝k-mers。接着利用这些k-mers来建立scaffold，用于高度可靠的长读长比对，只有那些能与独特k-mers比对的长读长被保留。在重复密集区域（如着丝粒）中，单拷贝k-mers的间距是不规则的。例如，X染色体上两个k-mers之间观察到的最长距离为53 kb，这意味着跨越染色体的这一部分需要≥53 kb的读长。

她们对纳米孔读长进行两轮的polish，加上对其它测序平台的长读长进行polish，然后使用HiFi比对来评估polish是否成功。Karen表示，T2T X染色体具有从端粒到端粒的结构验证组装，包括了在X着丝粒处的2.8Mb串联重复。她认为，这种策略“真正为我们带来了高质量和高连续性”。

Karen最后表示，未来两年的目标是获得完整的人类基因组。“我们面临的挑战包括中心粒区域、大的片段重复以及经典的卫星序列，我们需要考虑重复组装的自动化。我们在组装质量和完整性方面为遗传学界设定了越来越高的标准。从2020年开始，我们要考虑人类群体，而不是个人基因组。这就需要在PromethION上开展更高通量的测序，现在我们开始加快这一进程，”Karen谈道。