数字PCR引物探针设计——Gene-π课堂之二

【字体: 时间:2019年05月10日 来源:深蓝云生物

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  上一讲我们给大家介绍了数字PCR的原理及应用,今天给大家讲一讲引物探针的设计。好的引物探针是实验成功的关键。

上一讲我们给大家介绍了数字PCR的原理及应用,今天给大家讲一讲引物探针的设计。好的引物探针是实验成功的关键。详细信息可登陆网站或扫描二维码查看。

   

数字PCR引物与普通PCR引物设计要求不同:普通PCR的目的是获得目的基因,对非特异性反应和引物二聚体要求不严格;而数字PCR引物跟real-time PCR引物一样对非特异性反应和引物二聚体要求严格。

引物及探针设计的总体原则

▪ 先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
▪ 所选列应该高度特异,尽量选择具有最小二级结构的扩增片段。
▪ 扩增长度应不超过400bp,理想的最好能在50-150bp内。
▪ 保持GC含量在30%~80%之间。
▪ 为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是G(不能有4个连续的G)。
▪ 将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发夹结构的形成。
▪ 一些需额外考虑的因素:
  ◦ 引物的3’端避免使用碱基A,引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 。
  ◦ 如果不能避免二级结构,那么就要相应提高退火温度。
  ◦ 尽量避免Dimer(二聚体)配对区域在3’末端。
  ◦ 尽量避免3’末端连续几个碱基错配形成False priming(错配)
  ◦ 衡量二级结构的稳定性
  如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应,如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应;尽量保证自由能的绝对值<10(可选)
  ◦ 为了避免基因表达过程中检测到DNA,设计应尽量跨内含子区,这可确保扩增的产品只能使用mRNA作为模板。


引物设计基本原则:

▪ 扩增片段长度:50-150个碱基
▪ 引物长度:18-24个碱基(20个碱基最优)
▪ Tm值:58℃到 60℃,引物之间的Tm相差避免超过2℃
▪ GC含量:30%到80%
▪ 3’端的最后5个碱基内不应有超过2个G+C
▪ 尽量避免重复的核苷酸序列,尤其是不能有4个连续的G
▪ 探针位置尽可能地靠近上游引物,但不能重叠

探针设计基本原则:

▪ 探针长度:13-25个碱基(MGB探针)
 13-30个碱基(普通Taqman探针)
▪ Tm值:68 °C 到 70 °C(PrimerExpress 计算结果)
 通常比引物Tm值高5-10℃(至少要5℃)
▪ GC含量:30%到80%
▪ 5’端第一个碱基不能为G
▪ 尽量避免重复的核苷酸序列,尤其是不能有4个连续的G;避免6个连续的A出现
▪ 对于MGB探针,尽量避免在探针的中部出现2个或2个以上连续的C,3’端的碱基应避免为“GGG”或“GGAG”
▪ 对于FAM 标记的探针,5’端的第二个碱基不能为G
▪ 整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量

探针荧光标记物选择:

多重探针设计原则:

▪ 所有靶基因的引物或探针的Tm 值要相接近,引物的Tm 值建议在55-60℃,探针的Tm 值高于引物Tm 值5-10℃。
▪ 不同靶基因的探针标记不同的荧光基团,比如FAM、HEX或CY5,并且要选择发射波长之间渗透最小的荧光报告基团,
▪ 同时要与数字PCR 系统的荧光检测通道参数兼容。

推荐引物探针设计软件:Beacon designer、Primer 3、Primer express等

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