原代细胞培养：爱与痛的边缘

　　

“细胞生物学和细胞培养领域在过去十年发生了巨大变化，”STEMCELL Technologies的高级科学顾问Jackie Damen如是说。

在过去，科学家往往依赖永生化的细胞系，而如今，新型的技术和试剂让培养和利用原代细胞变得更加可行。原代细胞和3D培养模型的融合让科学家有能力在体外创建出一个更接近体内生存条件的微环境。

原代细胞来源于人或动物的活体组织，经解离后用于体外培养。这些细胞保留了原始组织的主要特征，包括生长和衰老。有些原代细胞可传代几次，有些则根本无法传代（如神经元），这就使得原代细胞的工作好似一把双刃剑。

原代细胞的培养可带来更好的疾病模型，让精准医疗早日成为现实。不过，如何经济高效地培养原代细胞，并围绕有限的几代细胞来设计实验，这也是一个难题。

原代细胞：爱与痛的边缘

原代细胞曾是出了名的难培养，需要耗费大量的时间、成本和资源。即使细胞捱过了极其严苛的解离步骤，但污染仍然是一个隐患，有可能让几天的成果化为乌有。此外还存在其他细胞污染、生长缓慢以及数量有限的问题。

如今，研究人员不再为这些问题头疼。许多公司销售现成的原代细胞，并配有培养基和生长因子。STEMCELL的原代细胞主管Debra Sauvé表示：“为了确保细胞有可靠的来源，研究人员应当与供应商合作，这些供应商有着庞大的供体网络。”这有助于缓解细胞数量有限的压力。STEMCELL提供一系列原代细胞，包括外周血单核细胞。

ATCC的高级产品线业务经理Kevin Grady则表示，这其实是一种权衡。培养原代细胞的成本可能更高，但更接近体内环境的模型让研究人员能够以一种更高效的方式寻找答案。他表示，ATCC的原代细胞经过纯度和性能的全面测试。

原代细胞正迅速成为细胞和分子生物学研究的首选工具，为正常细胞、疾病进展和疗法开发等研究提供了高质量的模型。例如，患者衍生的类器官（PDO）就是精准医疗中的一种新工具。

以往，癌细胞系和患者衍生的异种移植物（PDX）模型是常用的临床前模型，其中PDX是将患者的肿瘤移植到免疫功能不全的小鼠中。与PDX相比，POX带来了相同的药物反应可预测性，同时降低了小鼠研究的成本以及潜在的伦理问题。

“如果研究人员想了解生理和发育通路，尤其是那些控制疾病的通路，那么他们应该考虑原代细胞，而不是永生化细胞，”Damen说。据她介绍，永生化细胞系的背景与来源组织相去甚远，许多生理活动无法重复。

细胞系：价廉却非物美

细胞系因容易培养且产量可观而成为研究首选。然而，它们并不完美。细胞系会不断突变。连续传代导致它们的基因型和表型发生变化。有时候，它们已经变得面目全非。一个研究小组曾经发现，HEK293细胞系的腺病毒转化产生的细胞更接近未成熟神经元，而不是人胚肾细胞。

错误鉴定也是一个大问题。以MDA-435细胞系为例，它一直被视为乳腺癌细胞而广泛使用，并且有数千篇文献引用。然而，如今越来越多的证据表明，它是一种黑色素瘤细胞系。

错误细胞系和污染细胞系的持续使用，不仅造成了天文数字般的浪费，也产生了无法再现的不可靠数据。据估计，在使用培养细胞的文献中，大约20%都有受污染的数据。国际细胞认证委员会（ICLAC）目前列出了529种细胞系被交叉污染或错误鉴定。

同时，细胞系无法重现来源组织的许多生理特征。“二维培养的永生化细胞在功能上是一维的，”Damen说。她认为这些细胞系无法重现生长和成熟之间的关联，与细胞分化的正常过程脱离。

当然，这并不是说永生化的细胞系没用，只是在使用这个模型时必须更加小心，也要认识到它的局限性。Grady认为永生化的细胞系在科研工作中仍占有重要地位。它们是标准化方案和确认结果时的良好工具。

Cellecta的研究科学家Sylvain Baron认为，无限分裂和容易培养使得细胞系特别适合那些需要大量细胞的实验，比如全基因组遗传筛选。他认为原代细胞数量有限且挑剔难缠，这限制了许多实验的开展。

新一代的“原代”细胞系

STEMCELL的产品经理Amanda Fentiman表示：“尽管很难获得足够的原代细胞进行分析，但除了使用更多的组织，似乎没有更好的方法。”不过她表示，新的成像系统和免疫荧光技术可以取代传统的分析方法，如western blot。“基于单细胞的western blot、单细胞测序以及微流体设备所需的样品比传统方法要少得多，”她解释说。

当然，有些时候仍然要使用老式的western blot。“对于很难获得的细胞类型，hPSC（人多能干细胞）来源的细胞和hTERT（人端粒酶逆转录酶蛋白）修饰的细胞就变得非常有意义，”STEMCELL的资深科学家Erin Knock说道。

虽然hTERT、PSC和iPSC来源的细胞系并不是真正的原代细胞，但它们是十分重要的替代品，体现了原代细胞的一些最佳品质。例如，强制表达hTERT让原代细胞能维持足够的端粒长度，避免增殖性衰老。

“hTERT诱导的原代细胞具有连续传代的能力，没有染色体不稳定性，”Knock谈道。这种细胞可以扩增，也可以冷冻、保存和解冻，以适应实验的时间安排。同样地，她认为PSC的真正价值在于能够从一种细胞分化成多种细胞类型。iPSC让研究人员能够采集轻松获取的细胞，并将它们转变为不易获取的细胞。

目前iPSC和类器官领域的研究正在明显增加。“随着人们掌握了iPSC的技术，许多新型的‘原代’细胞系已经建立，让人们在鉴定与健康和疾病相关的细胞因子和通路方面取得了重要进展，”Damen谈道。

**处理原代细胞的小贴士**

1. 细胞系本身存在一些缺点，动物模型的难度大、成本高，而原代细胞就介乎两者之间。若使用得当，原代细胞既可以带来生物学相关的结果，又可以节约时间和经费。

2. 目前，市场上多家供应商提供现成的原代细胞，并配备充分优化的培养基和实验方案。这使得原代细胞的操作比以往要轻松得多。在开展大规模研究之前，试着与供应商接触一下，看看能否对各个批号进行测试。

3. 在自行制备原代细胞时一定要小心。分离技术不过关可能导致表型不一致，污染发生、细胞生长状况不佳或死亡。如果您选择自行分离原代细胞，专家仍建议您购买专门的培养基，并以商业化的细胞作为对照。

4. 在分离过程中使用抗生素。抗生素溶液应当是新鲜配制的，或者使用新鲜解冻的溶液，使用一次后即丢弃。准备好支原体检测试剂盒，比如ATCC的PCR通用型支原体检测试剂盒（ATCC® 30-1012K™）。

5. 永远不要低估看似简单的技术。原代细胞应保存在液氮中，直至解冻。解冻过程是很快的。在培养时请注意，原代细胞对温度敏感，因此应避免反复升温和冷却。同时请注意汇合度：100%的汇合度会导致细胞衰老。

6. 原代细胞的数量有限或无法增殖，这个缺点可以通过样品量需求较少的新型细胞成像和western blot技术来克服。不过，hTERT和PSC来源的“原代”细胞有望消除样品量的限制，成为新的替代方案。

（作者：Lauren Tanabe / 生物通编译）