BioTechniques:三种miRNA检测方法的比较

【字体: 时间:2019年07月02日 来源:生物通

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  miRNA是大有希望的生物标志物,但精确检测和定量并不是一件易事。为此,捷克的研究人员近日评估了三种miRNA检测技术,比较了它们的定量偏倚、一致性和稳健性。他们在《BioTechniques》杂志上发表了分析结果。

  

miRNA是大有希望的生物标志物,但精确检测和定量并不是一件易事。为此,捷克的研究人员近日评估了三种miRNA检测技术,比较了它们的定量偏倚、一致性和稳健性。他们在本期《BioTechniques》杂志上发表了分析结果。

目前,研究人员已经开发出多种方法来检测miRNA,包括RNA测序、芯片和RT-qPCR。测序法和芯片法的优势分别在于发现新颖的miRNA,或寻找与疾病相关的差异表达miRNA,适合高通量的miRNA分析,但不适合常规使用。对诊断领域而言,最具潜力的方法仍是金标准的RT-qPCR。

RT-qPCR方法大家都很熟悉,通常是先将成熟的miRNA转化成cDNA序列,然后利用qPCR进行扩增。这种技术可以在标准的设备上自动化开展,因此如今已被广泛使用。qPCR方法的灵敏度、特异性和重复性都是非常好的,但整个过程中最容易出错的步骤是逆转录(RT)反应。

不过,最近又涌现出一些检测miRNA的新颖方法。第一种方法称为SplintR-qPCR,它保留了qPCR检测过程,但改变了cDNA合成的过程。这种方法利用SplintR连接酶将与miRNA互补的探针A和探针B相连接,以取代RT过程。由于DNA探针与miRNA之间只需要4-6 bp的重叠,故在设计探针时具有更大的灵活性。

第二种方法是基于免疫分析的miRNA定量方法——miREIA。此方案是利用DNA探针与miRNA靶点进行杂交,然后再利用独特的单克隆抗体对DNA/RNA杂交体进行定量。它的检测原理与ELISA相似,使用常规ELISA设备,便于临床实验室开展。整个过程不涉及到RT或扩增。

在此,研究人员比较了这三种检测方法在临床应用中的表现。他们利用赛默飞的TaqMan miRNA assay或TaqMan Advanced assay开展RT-qPCR;或利用NEB的SplintR连接酶按照文献中的方案开展SplintR-qPCR;或采用BioVendor的miREIA方案进行检测。他们检测了30个样本中miR-142-5p、miR-23a-3p和miR-93-5p的浓度。

研究人员发现绕开RT过程的方法所测得的浓度具有一致性,而RT-qPCR方法测得的浓度有三个对数的偏移,即测出的浓度大约高了1000倍。他们推测,可能的原因在于RT步骤本身。miRNA分子的长度仅为19-23个核苷酸,且序列非常相似,这就使得RT的引物设计非常复杂。

之后,他们又评估了这三种检测方法的稳健性。结果表明,miREIA技术的稳健性最佳,对于全血和PBMC样品,变异系数(CV)分别为17%和8%。SplintR-qPCR的结果很相似,CV分别为19%和16%。不过,RT-qPCR方法的稳健性最差,CV分别为39%和50%。

基于此,研究人员认为绕开RT过程的miRNA检测方法更适合临床应用。不过,RT-qPCR仍然是最灵敏的方法,在miRNA测定中无疑将占有一席之地。同时,SplintR-qPCR和miREIA方法更加稳健,绝对定量更精准。它们适用于以组织和全血为样本的临床实验室,但在灵敏度方法还需要进行一些开发工作。(生物通 薄荷)

原文检索

Evaluation of miRNA detection methods for the analytical characteristic necessary for clinical utilization

BIOTECHNIQUES VOL. 66, NO. 6

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