我行我上:教你如何提取高纯度的完整外泌体

【字体: 时间:2019年07月18日 来源:宝柏

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  前方温馨提示:这是一篇关于外泌体提取试剂盒的软广。

  

如果您正在或者准备或者计划开展外泌体研究,欢迎加入我们的外泌体小课堂。

首先,来个自我介绍:
我是MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS,来自日本FUJIFILM Wako品牌。


 
品牌背景:FUJIFILM Wako前身为和光纯药株式会社,成立于1922年,是日本最大的试剂企业,也是全球一流的试剂供应商,在欧美都设有分公司。自成立以来一直致力于高品质的试剂生产与开发,并获得ISO9001、ISO/IEC17025、ISO14000等多项国际认证。2017年被大佬FUJIFILM Group(富士胶片集团)斥资全面收购(你没看错,就是做相机、胶卷的那个富士),更名为富士フイルム和光純薬株式会社(FUJIFILM Wako)。

 外泌体提取试剂盒是FUJIFILM Wako的明星产品哦,有关外泌体、如何成功获取高质量的外泌体等问题,请跟随勤学好问的小和同学一起进入外泌体小课堂,学识渊博的小光老师将一一为您解答。

小和同学:为什么有的参考文献写外泌体,有的文献写细胞外囊泡(EVs)呢?这两种称呼是同一样东西吗?
小光老师:由欧洲多国细胞外囊泡领域的学者发起并成立的国际细胞外囊泡协会(ISEV)于2014年在协会会刊Journal of Extracellular Vesicles发表了一个指导性意见,也就是我们常说的MISEV2014。2018版《指导要求》进行了修订。2018版的《指导要求》首先讨论了对这些细胞来源的非细胞具膜结构如何称呼。学者们普遍认为应当使用细胞外囊泡(extracellular vesicle)来称呼这些具膜囊泡,当我们使用常规方法分离这些结构时不推荐使用其他的名称来称呼它们。外泌体(exosome)仅适用于通过特殊手段拿到的由胞内体来源的释放到细胞外的膜泡结构。建议对细胞外囊泡进行细分时使用物理上的界定如小细胞外囊泡(sEV)和中/大细胞外囊泡(m/lEV),或者高密度囊泡(high density)和低密度囊泡(low density)等,同时也建议使用表面蛋白来界定如CD63+CD81+细胞外囊泡等。当使用exosomes等称呼时应当进行严谨的实验证明使用的“exosomes样品”是由胞内体途径产生的。

小和同学:都是细胞外囊泡,外泌体和微囊泡有啥区别?
小光老师:外泌体和微囊泡的区别在于其生成的方式不同。从晚期内体来源产生的细胞外囊泡称为外泌体,从细胞膜直接出芽产生的细胞外囊泡称为微囊泡。二者的大小也有所不同,外泌体的粒子直径在40~100nm范围,微囊泡的粒子直径在100~1,000nm,但有报道发现也存在直径较小的微囊泡,所以无法明确从粒子大小来区分二者。 

小和同学:国际上有公认的外泌体提取方法吗?我应该如何选择?
小光老师:2018版《指导要求》说明外泌体没有限定单一的分离手段,多种手段都可以进行细胞外囊泡的富集。《指导要求》编写者们认为“高回收率,低特异性”的富集手段是指那些富集囊泡的同时会有大量的非囊泡组分被富集,甚至细胞的整个分泌组都会被掺入其中,归入这一类的分离手段主要包括通过改变电荷或通过高聚物作用的沉淀试剂盒、低分子量截流的超滤分离、超长时间和超高离心力的超速离心等。Wako的MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS(产品编号299-77603(2tests),293-77601(10tests)),使用PS亲和法对外泌体进行提取,损失小且能获得高纯度的外泌体。

小和同学:提问🙋MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS可以提取哪些细胞外囊泡?
小光老师:可提取脂质膜表面暴露出磷脂酰丝氨酸(PS)的外泌体和微囊泡。

小和同学:是不是所有的外泌体都会暴露磷脂酰丝氨酸(PS)呢?
小光老师:PS不是你想有,想有就能有,迄今为止所发现的外泌体,并非所有的外膜表面都暴露PS。例如,细菌来源的外泌体膜表面没有PS,因此,本款试剂不能提取这种外泌体。
现在的研究尚未得知是否所有的外泌体上都会露出PS,但是上述的外泌体标记根据细胞种类不同表现出的信号强弱差大,通过利用本试剂盒PS亲和法捕捉、提取外泌体是较好的方法。

小和同学:这个MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS,1次提取的外泌体量大概是多少?
小光老师:实验样品的种类和体积不同,提取的外泌体量也不一样。Wako的操作实例中,一次提取操作可获得蛋白量约30μg/mL(BCA法检测),粒子数1~2×1010(NanoSight LM10检测)(经莫能菌素钠刺激外泌体分泌的K562 培养上清5mL浓缩为1mL后,对其进行提取)。另外,和光验证了从1mL正常人混合血清提取一次,可回收约34μg/mL蛋白质(BCA法检测),约5×109/mL的粒子数(NanoSight LM10检测)。本试剂盒最终可获得100μL的洗脱液。

小和同学:我们实验室最近经费有限呢,Exosome Capture 固定化磁珠可以循环利用吗?
小光老师:可以。为了能够高效提取细胞培养上清中的外泌体,磁珠可重复使用5次(同一样品)。试剂盒里的缓冲液含5次提取需要的量。1mL体积以上细胞上清样本建议进行浓缩后再回收,提取时可进行反复抽提,提高提取效率。用血液样品进行实验时,需要根据磁珠状况来判断是否能重复利用;若磁珠发生聚集,利用涡旋仪也无法使磁珠分散,不建议继续使用。详情参考操作说明书。

小和同学:太好了👏👏,这样实验成本瞬间就降下来了,那样品纯化所需的最低量是?
小光老师:使用旋转器的需要500μL以上,使用离心管混合器的需要100μL。样品量更少的情况下加TBS到所需最低量后再使用Exosome Capture 固定化磁珠。

小和同学:电镜分析需要外泌体的量是多少?
小光老师:能用电镜观察到2-4×1010的粒子(通过NanoSight LM10检测)。
小和同学:提取量外泌体之后,该怎么做下游的Western Blot呢?要不要加RIPA裂解?
小光老师:日本和光从100 μL外泌体提取液中取15 μL,加入5 μL的 4×SDS样品Buffer,共20μL的样品全量上样进行SDS-PAGE。不需要再用RIPA提取了。这里我们推荐使用货号为Wako的鼠源Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) (产品编号016-27061)来作为一抗,灵敏度更高,所需样本量更少哦!

小和同学:用该试剂盒提取出来的囊泡怎么判断是外泌体呢?
小光老师:方法很多呢,可以用和表面抗原对应的抗体进行免疫印迹(WB)、透射电子显微镜(TEM)、纳米粒径分析(如NanoSight LM10)等来验证。前面也说了,ISEV建议用表面蛋白来界定所提取的细胞外囊泡,所以用CD63来做WB或ELISA是必不可少的了。使用Wako的PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP)(产品编号298-80601),既能鉴定外泌体的CD63信号,又能进行定量、定性分析,一举两得!

小和同学:既然这么好,说了那么多,为了发表一篇blingbling的文章,请问哪里能买到?
小光老师:请联系Wako的官方代理:宝柏•中国(www.boppard.cn)。
 
快来get一款损失小且能获得高纯度外泌体的高性价比试剂盒:MagCapture!

 

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