如何获得定量western blot数据

【字体: 时间:2019年07月02日 来源:深蓝云生物

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  小编提供了实用的实验操作的建议,关于如何获得高质量的、定量的western blot数据,以便您可以得出稳定的实验结果。

与所有的检测方法一样,western blot数据的质量和定量是在检测过程中最薄弱、变化最多的环节。准确度和重现性最差的步骤将限制western blot定量程度。小编提供了实用的实验操作的建议,关于如何获得高质量的、定量的western blot数据,以便您可以得出稳定的实验结果。

1.定量的定义

在讨论如何从western blot中获得定量数据之前,先定义一下我们所说的“定量”是什么意思是很有用的,何为定量,必须符合下列准则:

• 使用一个定义的过程进行测量,即western blot
• 这个过程产生一个可重复的结果,即是精确度
• 测量反映了一个“真实”的结果,即是准确度

Western blot过程需要明确定义以及尽可能保持一致的步骤,数据需要可重复,并且数据应该与使用正交方法收集的数据一致,例如质谱分析法。

在本文中,我们将重点讨论如何满足这些标准,强调在哪些地方需要特别注意一致性或执行试剂验证和质控,可以获得western blot可靠性和重现性的数据。

2.使用相同的方法处理样品
 

一致的样品制备和处理是产生定量western数据的重要的第一步。甚至是孵育时间、buffer成分或温度上的微小差异(可变的室温,在-20℃冷冻与在冰上保存),也会显著降低western blot数据的重现性。一旦建立了可靠的细胞或组织裂解和样品处理方案,在准备相互比较的样品时,应尽可能地遵循该程序。

3.抗体验证

期刊杂志需要一些抗体验证的信息,事实上,对于检测感兴趣蛋白,这是一个很好的实验技术,在你自己的实验室里用你自己的样本和技术来验证抗体。这在使用以前从未发表过的抗体时尤其重要。

仅仅验证你的抗体检测到蛋白在预期分子量是不够的。重要的是要表明结合是特定于目标蛋白的,最好通过多种方法。国际抗体验证工作组已经发布了一套很好的建议,其中列出了五种不同的抗体验证方法。其中四种适用于验证Western blotting中使用的抗体,我们在这里总结了这些验证方法。

▪ 基因验证:通过敲除基因或通过RNAi消除目标蛋白的翻译,通过显示蛋白表达信号被消除或减少来证明抗体的特异性。
▪ 正交验证:证明使用抗体测量蛋白丰度与使用质谱法等正交方法测量蛋白丰度有很大相关性。
▪ 独立抗体:证明使用你自己的抗体测量蛋白丰度与使用第二种已验证的抗体测量蛋白丰度密切相关,该抗体可以识别同一目标蛋白上不同的、不重叠的表位。
▪ 标记蛋白表达(这是独立抗体方法的一种特殊变体):表达一个带有附加表位标签的靶蛋白,并指出使用你自己抗体测量蛋白丰度与使用识别表位标记的验证抗体测量蛋白丰度相关性。

请注意,抗体验证是特定于应用程序的——为ELISAs验证的抗体不为western blotting验证(反之亦然),因为结合发生在明显不同的条件下。

4.验证信号线性,优化动态范围

为了从western blot中获得准确的测量结果,您需要确保检测到的信号与当前的蛋白量成正比,换句话说,检测在线性范围内。然而,在western blotting过程中有多个步骤可以导致信号饱和,因此需要在每个步骤中验证信号的线性。注意,其中许多步骤还可以优化,以最大限度地提高信号的动态范围。

验证所使用的样本量在线性范围内

为了获得最稳健的定量蛋白印迹数据,我们建议生成一条标准曲线,涵盖您将评估的全部样品量,测试每个量的多个重复样品(图1)。信号强度与样本量的关系图将表明您可以加载多少蛋白,并且仍然可以确信您的信号处于线性范围内。

请注意,应确定每个抗体 - 蛋白对应的系统线性范围。

检查转印条件对信号线性的影响

膜能容纳蛋白的数量可能饱和。我们建议测试几个转印时间,并选择可形成线性信号的最短时间。如果在测试的所有转印时间信号都保持饱和状态,那么很可能是其他的步骤导致了信号饱和。在这种情况下,可以继续优化其他参数,然后返回转印时间,验证膜容量是否饱和。

滴定抗体

我们建议针对您期望检测的全部靶蛋白量测试不同的抗体稀释度。 这将确保您的检测灵敏度足以检测最低量的目标蛋白,并且具有足够宽的动态范围,可检测到最高量的蛋白仍处于线性范围内(图2)。


图2.滴定一抗,寻找最佳稀释倍数。在10 mL Azure化学发光封闭缓冲液中
加入三种不同量的一抗,其他western blot条件不变。最佳抗体加入量是5 μL。

优化图像采集时间

评估线性的最后一步是印迹到检测系统的曝光时间,无论是胶片还是数字成像仪或扫描仪。 都需要有个合理的曝光时间保证能检测到弱信号蛋白同时强信号蛋白还不过曝,仍处于线性范围内。

选择合适的底物液用于定量化学发光western blot

通过适当的质控和正确的ECL底物化学发光也可以定量。选择一个动态范围广,灵敏度高,半衰期长的底物液进行可靠和可重复的定量。

动态范围受检测技术的影响

胶片的动态范围通常在1 log范围内,这是一个相当窄的动态范围。相比之下,PMT(光电倍增管)的动态范围可以在大约6.3log。

5.总蛋白归一化

归一化对于可靠的western blot定量是至关重要的——通过找到一个期望在不同样品和条件下保持不变的量,您可以质控样品制备、上样和转印的变化,并生成目标蛋白对该不变特征的相对值。

一种广泛使用的方法是使用看家蛋白进行归一化,例如GAPDH, tubulin和 actin,其被认为具有稳定且不变的表达水平。 最近的一系列研究表明这种假设有很多缺陷,现在许多免疫印迹专家和科学期刊,如Journal of Biological Chemistry杂志,建议使用总蛋白进行归一化。而不是看家蛋白质,除非用于归一化的看家蛋白进行稳定表达验证2,4,5,6


6.使用一致的western blot协议

仔细严格地遵循既定方案有助于减少变异性并提高测量精确度,从而实现稳健的定量蛋白印迹。 您不仅应该通过使用相同的试剂或实施批次对照来减少变异性,保持孵育和洗涤时间相同也有助于确保一致和可靠的结果。

参考文献:
1. Janes KA. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Sci Signaling. 2015 Apr 7;8(371):rs2. PMCID: PMC4401487.
2. McDonough AA, et al. Considerations when quantitating protein abundance by immunoblot. Am J Physiol Cell Physiol.2015 Mar 15; 308(6): C426–C433. PMCID: PMC4360027.
3. Uhlen M, et al. A proposal for validation of antibodies. Nat Methods. 2016 Oct;13(10):823-7. PMID: 27595404.
4. Fosang AJ and Colbran RJ. Transparency Is the Key to Quality. J Biol Chem. Dec. 11 2015. 290(50). 29692–29694. PMCID: PMC4705984.
5. Mortiz CP. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 2017 Oct; 17(20). PMID: 28941183.
6. Thacker JS, et al. Total protein or high-abundance protein: Which offers the best loading control for Western blotting? Anal Biochem. 2016 Mar 1;496:76-8. PMID: 26706797.
7. Liu Y, et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nat Biotechnol. 2019 Mar;37(3):314-322. PMID: 30778230.

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