David Liu又一篇:快速进化碱基编辑器可提高编辑效率

Broad研究所的David Liu和来自哈佛大学和波士顿儿童医院的同事在Nature Biotechnology上发表了一项研究“Continuous evolution of base editors with expanded target compatibility and improved activity”，介绍了他们开发的一种利用噬菌体辅助连续进化（PACE）碱基编辑器，以提高其编辑效率和目标序列兼容性的系统。

　　

噬菌体辅助连续进化（PACE）每天可进行数十代的突变、选择和复制，从而可产生具有提高目标序列兼容性和更高活性的碱基编辑器。

研究人员使用这种BE-PACE系统来进化胞嘧啶碱基编辑器CBE，以克服野生型CBE的靶向序列限制性。获得的进化CBE之一，被命名为evoAPOBEC1-BE4max，在GC环境中编辑胞嘧啶的效率可提高达26倍，同时在所有其他测试序列环境中均可保持有效编辑——这显著突破了野生型APOBEC1脱氨酶所受GC环境下的限制。另一种名为evoFERNY的进化脱氨酶，比APOBEC1小29％，并能够在所有测试的序列背景中有效编辑。

研究人员指出，嘧啶碱基编辑器CBE是最常用的碱基编辑器，而限制CBE效率的一个因素是APOBEC1的天然序列背景偏好——它对GC motifs编辑效率很低。位于编辑窗口中心的GC目标可以被基于APOBEC1的CBE有效编辑，但其他GC不行。先前的研究表明，虽然含有不同胞苷脱氨酶的CBE可以更有效地编辑GC靶标，但非APOBEC1的CBE替代品偏偏在其他靶标——比如在人类细胞中的各种靶标上——的平均性能低于APOBEC1-CBE。

鉴于这些挑战，研究人员尝试使用噬菌体辅助连续进化（PACE）嘧啶碱基编辑器CBE——噬菌体辅助连续进化系统每天可进行数十代的突变、选择和复制，从而可产生具有提高目标序列兼容性和更高活性的碱基编辑器。在PACE期间，感兴趣的活性与编码具有该活性的生物分子的M13噬菌体相匹配。在BE-PACE系统中，该回路必须通过单碱基变化来激活，响应少量编辑事件并快速开启，以便在连续稀释条件下能支持噬菌体繁殖。

为了满足这些要求，该团队设计了一个基因回路，其中需要在某个转录模板链上发生胞嘧啶脱氨作用，以恢复某个蛋白质中的失活突变。研究人员构建了这个低严谨度的、带有一个需要编辑GC的靶标以支持大量噬菌体繁殖的BE-PACE回路，结果使得宿主细胞培养物中过夜噬菌体增殖近10倍，对碱基编辑噬菌体的选择性超过1,000倍。在进一步的验证实验中，他们发现BE-PACE产生了性能改善的脱氨酶。

在经过连续的PACE回路之后，他们分离出那些在GCC1回路上显示出可测量弱活性的突变噬菌体，这最后得到了表现最佳的噬菌体克隆——当在荧光素酶分析的GCC1回路上测试时，其活性显示出高达28倍的提高。

为了确定荧光素酶测定中所得到的表观活性改善是否能转化为改进的哺乳动物细胞基因编辑，该团队将一组进化的脱氨酶变异体亚克隆到BE4max碱基编辑器的结构中并将它们转染到HEK293T细胞中，同时以靶向5个先前实验表明能够进行有效编辑的基因组位点的Guide RNA对照。

“在最优化的质粒剂量和条件下，我们观察到活性窗口中心的编辑效率达到最高约60％至80％，可能受限于CBE非依赖性因子——如转染效率或细胞DNA修复过程，”作者表示， “值得注意的是，对于所有进化的碱基编辑器，在远离活动窗口中心的位置进行编辑均得到了改善，这些位置的编辑值与荧光素酶测定活性相关。在APOBEC1 CBE中，包括H122L和D124N在内的进化突变导致在GC目标进行的碱基编辑发生了显著地改善。”

基于这些结果，研究人员对每种脱氨酶都选择了一个表现好的进化变体来深入表征：evoAPOBEC1，evoFERNY和evoCDA1。他们创建了BE4max变异体并测试了它们的编辑活动，并对一组24个CBE变异体进行了表征，以剖析进化突变的作用。他们发现在APOBEC1 PACE期间，在1,189个天然存在的APOBEC序列中有不到1％出现了关键的H122L和D124N突变进化，并且通常是共同发生。

“EvoAPOBEC1-BE4max在GC目标上的表现显著优于现有的CBE BE4max和AncBE4max，同时在非GC目标上表现出相似或更高的活性，”作者总结表示， “evoAPOBEC1-BE4max的碱基编辑窗口与BE4max的碱基编辑窗口非常相似。尽管与APOBEC1相比其大小缩小了29％，但在非GC目标的CBE中，evoFERNY与APOBEC1相当，在GC目标上evoFERNY更有效。EvoFERNY-BE4max显示进一步改善了对GC目标的兼容性，与evoAPOBEC1-BE4max相比，可提供相似或更高的编辑水平。

然而，研究人员补充说，在他们的所有实验中，evoCDA1-BE4max显示出脱靶编辑的增加。因此，他们建议将其用于最适合其特性的精心选择的应用中。“在好的编辑位点上，这种CBE可以产生更高的indels而不会增加异常水平的编辑，显示更宽的编辑窗口。” “相比之下，在不好的编辑位点，它显示了增加的窗口内编辑水平，而没有增加indels。这些考虑表明，evoCDA1-BE4max应该用于高效编辑优先且脱靶和旁侧编辑不重要时。”

过往回顾

2019年5月20日，David Liu在Nature Biotechnology 在线发表题为“Circularly permuted and PAM-modified Cas9 variants broaden the targeting scope of base editors”的研究论文，该研究使用循环置换的Cas9变体产生四个胞嘧啶和四个腺嘌呤碱基编辑器，编辑窗口从——4-5个核苷酸扩展到最多——8-9个核苷酸和减少副产物的形成。这组碱基编辑器改进了胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑的靶向范围。

2019年5月17日，David Liu团队在Nature Communications上发表题为“Development of hRad51–Cas9 nickase fusions that mediate HDR withoutdouble-stranded breaks”的文章，报告了通过将hRad51变体与可编程切口酶融合以产生hRad51-Cas9（D10A）切口酶融合物（RDN变体），实现具有最少副产物和减少脱靶编辑的无DSB HDR。

2019年5月13号，David Liu团队在Nature Chemical Biology上在线发表了题为“Substrate-selective inhibitors that reprogram the activity of insulin-degrading enzyme ”的研究论文，该研究发现了能改变IDE底物选择性的强效和高特异性的小分子抑制剂。这些发现为开发IDE靶向疗法提供了一条道路，并为以底物选择性方式调节其他酶以释放其治疗潜力提供了蓝图。

2019年5月8日， David R. Liu团队在Science Advances 在线发表题为“Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors”的研究论文，该研究证明当前的ABE在细胞RNA中产生低但可检测水平的广泛的腺苷 - 肌苷编辑。使用结构指导原则设计脱氨酶结构域中的突变，开发了新的ABE变体，在三种哺乳动物细胞系中保留了它们有效编辑DNA的能力，但显示出大大降低的RNA编辑活性，以及较低的脱靶DNA编辑活性和减少的插入缺失副产物（通过在TadA中引入E59A或E59Q突变以及在TadA *中引入V106W突变，从ABE中鉴定出广泛的，低水平的细胞RNA编辑，其大大减少，而基本上不牺牲靶上DNA编辑） 。 通过解耦DNA和RNA编辑活动，这些ABE变体通过最小化RNA和DNA脱靶编辑活性来提高腺嘌呤碱基编辑的精确度。

2019年4月26日，David Liu在Nature Communications上发表题为“High-resolution specificity profiling and off-target prediction forsite-specific DNA recombinases”的文章，开发了一种快速绘制SSR特异性决定因素的方法。这种方法也可用于预测SSR的细胞脱靶活性，这是评估SSR作为潜在工具或治疗剂时的重要考虑因素。研究结果表明，Rec-seq可以为SSR的应用及其进一步发展提供信息。

2019年2月25日，David Liu团队在Nature Medical Bioengineering 在线发表题为“ Adenine base editing in an adult mouse model of tyrosinemia”的研究论文，该研究使用基于CRISPR系统的碱基编辑器，第一次成功地在成体小鼠模型中治疗了由于G->A基因突变导致的这种罕见肝脏疾病。

2019年2月12日，David Liu团队在Nature Chemical Biology 上在线发表了题为“Side chain determinants of biopolymer function during selection and replication”的研究论文。研究揭示在选择和复制过程中生物聚合物功能的侧链决定因素，这些因素将可能有助于蛋白质在某些分子识别任务中比其核酸前体具有明显优势。

基因组编辑使用可编程核酸酶产生双链DNA断裂然后进行同源定向修复可引入多种修饰，但在非分裂细胞中效率低，并且通常伴有过量的不需要的插入和缺失，易位或其他染色体重排。碱基编辑直接修饰活细胞中的靶DNA碱基，并已广泛用于纠正人类胚胎的生物体中的点突变。碱基编辑使用催化受损的Cas9在指定的基因组位点打开单链DNA环，编辑窗口内的碱基（通常约5个核苷酸宽）通过仅接受单链DNA的碱基修饰酶修饰。到目前为止，已经开发了两类基本编辑器：CBE将C•G转换为T•A，ABE将A•T转换为G•C。

 

原文检索：Continuous evolution of base editors with expanded target compatibility and improved activity

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