CRISPRi和CRISPRa：超越基因编辑的新工具

CRISPR-Cas9系统的简约和高效使其迅速成为生命科学实验室的新宠。除了基因编辑，它还作为功能基因组筛选工具，帮助人们在全基因组范围内开展功能丧失研究。近来，CRISPR-Cas9工具箱已经大大扩展，新增了CRISPRi和CRISPRa这两种工具。本文就来介绍一下这两种工具，看看它们对功能基因组筛选而言有何好处。

不断扩大的工具箱

随着CRISPR-Cas9基因编辑技术的出现，研究人员如今能利用混合文库进行全基因组筛选。这种以RNAi为基础开发的方法是大多数实验室能够驾驭的，有助于阐明关键的信号通路和药物靶点。不过，CRISPR-ko带来的基因knockout并不能完全满足人们的要求。

于是，研究人员利用CRISPR技术开发出其他的扰动形式，比如转录沉默和表达激活。他们发现催化失活的Cas9（dCas9）在靶向原核启动子区域时会导致基因表达的抑制，这是由于转录机制的空间位阻效应。若将dCas9与阻遏结构域（如KRAB）融合，则能实现高效的转录沉默。这个过程被称为CRISPRi（CRISPR干扰）。由于DNA没有任何变化，故CRISPRi实现了可逆的knockdown，而不是knockout。

同理，dCas9融合体也可用来激活基因表达，这被称为CRISPRa（CRISPR激活）。与转录激活因子（如VP64和p65）融合的dCas9可靶向启动子和增强子区域，导致基因表达上调。为了增强“战斗力”，dCas9融合体需要招募多个激活结构域。目前人们已经开发出几种系统，包括多重融合体（VPR，即VP64、p65和Rta5的三重融合体）、使用蛋白质支架（如SunTag系统），以及使用RNA支架（如Synergistic Activation Mediator complex）。

功能基因组筛选

在第一项CRISPR-ko筛选结果发表后，CRISPRi和CRISPRa技术自然也扩展到基因组水平。Gilbert等人的原理验证工作证明了CRISPRi/a技术可引发全基因组范围的转录调控。利用这种可逆方法，他们鉴定出对霍乱/白喉融合毒素（CTx-DTA）产生反应的基因。CRISPRi筛选产生了与CRISPR-ko互补的结果，让人们深入了解必需基因，如DNA复制基因和核糖体亚基。

然而，dCas9的结合受到核小体的影响，如果被组蛋白与DNA的结合所阻断，那么dCas9融合体可能无法实现其功能。Horlbeck等人于是利用筛选数据和转录起始位点分析来优化sgRNA的定位。他们生成了一种高度优化的sgRNA设计算法，可确定适合CRISPRi和CRISPRa应用的最佳sgRNA。这一平台大大改善了CRISPRi性能，提高了它的效率和特异性。

当然，CRISPRi和CRISPRa仍是相对年轻的技术。与CRISPR-ko或RNAi等成熟技术相比，它的应用还不是很广泛。不过，一些近期发表的文献证明了这些技术的实用性。

应用1：长链非编码RNA

研究已经证明CRISPRi适用于长链非编码RNA的研究，并且与单细胞RNA测序相结合，它还能分析指导细胞分化的分子通路1。此外，研究人员还开发出一种全基因组CRISPRa文库，同时靶向编码区和非编码区，以鉴定影响白血病治疗效果的基因2。

应用2：分析耐药性

研究人员对BRAF V600E突变细胞进行CRISPRa筛选，以研究它们耐受BRAF抑制剂PLX-4720的机制。此次筛选鉴定出先前已知的耐药机制，比如EGFR和ERK通路激活，但也揭示了新的耐药机制，与G蛋白偶联受体（GPCR）有关3。

应用3：阐明细胞通路

Sanger研究所的杨健教授团队利用CRISPRa系统来鉴定与小鼠外胚层干细胞重编程相关的因子。他们总共鉴定出50个基因，以往未发现对重编程有贡献。这项工作证明了利用CRISPR技术有助于了解复杂细胞过程的分子机制4。

基因表达的精确控制

尽管CRISPR-ko是一种适用于遗传筛选的强大工具，但基因敲除的确存在其局限性。 CRISPR-ko产生真正的null表型，在筛选那些可被残留的低水平蛋白质表达所掩盖的较弱表型时有用，但不适合研究必需基因或药理学抑制。基因产物的药物抑制很少是绝对的，因此基因表达的部分敲除而非完全敲除将更好地模拟药物的作用。

在探测基因激活突变在生物学和疾病中的作用时，CRISPR-ko的能力也往往受到限制，因为它只能解决功能丧失的影响。由于基因在癌症期间经常被激活（比如KRAS和BRAF），因此CRISPRa在研究疾病的分子病理学上具有巨大潜力，也有助于人们研究由功能获得事件而引起的耐药性。

科学家现在也可以选择将CRISPR-ko筛选与CRISPRi或CRISPRa结合使用。这些实验同时进行，不但节省了大量的时间，再加上这些方法是一脉相承的，这可以大大增加两次筛选所鉴定出hit的可信度。此外，不同的筛选过程还可能鉴定不同的hit，从而不断扩大科学家可探索的潜在靶点库。

（作者：Lucy Thorne博士 / 生物通编译）

相关文献

1. Genga, R. M. J. et al. Single-Cell RNA-Sequencing-Based CRISPRi Screening Resolves Molecular Drivers of Early Human Endoderm Development. Cell Reports 27, 708-718.e10 (2019).

2. Bester, A. C. et al. An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance. Cell 173, 649-664.e20 (2018).

3. Konermann, S. et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature 517, 583–8 (2015).

4. Yang, J. et al. Genome-Scale CRISPRa Screen Identifies Novel Factors for Cellular Reprogramming. Stem Cell Reports 12, 757–771 (2019).