CRISPRi和CRISPRa:超越基因编辑的新工具

【字体: 时间:2019年07月26日 来源:生物通

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  近来,CRISPR-Cas9工具箱已经大大扩展,新增了CRISPRi和CRISPRa这两种工具。本文就来介绍一下这两种工具,看看它们对功能基因组筛选而言有何好处。

CRISPR-Cas9系统的简约和高效使其迅速成为生命科学实验室的新宠。除了基因编辑,它还作为功能基因组筛选工具,帮助人们在全基因组范围内开展功能丧失研究。近来,CRISPR-Cas9工具箱已经大大扩展,新增了CRISPRi和CRISPRa这两种工具。本文就来介绍一下这两种工具,看看它们对功能基因组筛选而言有何好处。

不断扩大的工具箱

随着CRISPR-Cas9基因编辑技术的出现,研究人员如今能利用混合文库进行全基因组筛选。这种以RNAi为基础开发的方法是大多数实验室能够驾驭的,有助于阐明关键的信号通路和药物靶点。不过,CRISPR-ko带来的基因knockout并不能完全满足人们的要求。

于是,研究人员利用CRISPR技术开发出其他的扰动形式,比如转录沉默和表达激活。他们发现催化失活的Cas9(dCas9)在靶向原核启动子区域时会导致基因表达的抑制,这是由于转录机制的空间位阻效应。若将dCas9与阻遏结构域(如KRAB)融合,则能实现高效的转录沉默。这个过程被称为CRISPRi(CRISPR干扰)。由于DNA没有任何变化,故CRISPRi实现了可逆的knockdown,而不是knockout。

同理,dCas9融合体也可用来激活基因表达,这被称为CRISPRa(CRISPR激活)。与转录激活因子(如VP64和p65)融合的dCas9可靶向启动子和增强子区域,导致基因表达上调。为了增强“战斗力”,dCas9融合体需要招募多个激活结构域。目前人们已经开发出几种系统,包括多重融合体(VPR,即VP64、p65和Rta5的三重融合体)、使用蛋白质支架(如SunTag系统),以及使用RNA支架(如Synergistic Activation Mediator complex)。

功能基因组筛选

在第一项CRISPR-ko筛选结果发表后,CRISPRi和CRISPRa技术自然也扩展到基因组水平。Gilbert等人的原理验证工作证明了CRISPRi/a技术可引发全基因组范围的转录调控。利用这种可逆方法,他们鉴定出对霍乱/白喉融合毒素(CTx-DTA)产生反应的基因。CRISPRi筛选产生了与CRISPR-ko互补的结果,让人们深入了解必需基因,如DNA复制基因和核糖体亚基。

然而,dCas9的结合受到核小体的影响,如果被组蛋白与DNA的结合所阻断,那么dCas9融合体可能无法实现其功能。Horlbeck等人于是利用筛选数据和转录起始位点分析来优化sgRNA的定位。他们生成了一种高度优化的sgRNA设计算法,可确定适合CRISPRi和CRISPRa应用的最佳sgRNA。这一平台大大改善了CRISPRi性能,提高了它的效率和特异性。

当然,CRISPRi和CRISPRa仍是相对年轻的技术。与CRISPR-ko或RNAi等成熟技术相比,它的应用还不是很广泛。不过,一些近期发表的文献证明了这些技术的实用性。

应用1:长链非编码RNA

研究已经证明CRISPRi适用于长链非编码RNA的研究,并且与单细胞RNA测序相结合,它还能分析指导细胞分化的分子通路1。此外,研究人员还开发出一种全基因组CRISPRa文库,同时靶向编码区和非编码区,以鉴定影响白血病治疗效果的基因2。

应用2:分析耐药性

研究人员对BRAF V600E突变细胞进行CRISPRa筛选,以研究它们耐受BRAF抑制剂PLX-4720的机制。此次筛选鉴定出先前已知的耐药机制,比如EGFR和ERK通路激活,但也揭示了新的耐药机制,与G蛋白偶联受体(GPCR)有关3。

应用3:阐明细胞通路

Sanger研究所的杨健教授团队利用CRISPRa系统来鉴定与小鼠外胚层干细胞重编程相关的因子。他们总共鉴定出50个基因,以往未发现对重编程有贡献。这项工作证明了利用CRISPR技术有助于了解复杂细胞过程的分子机制4。

基因表达的精确控制

尽管CRISPR-ko是一种适用于遗传筛选的强大工具,但基因敲除的确存在其局限性。 CRISPR-ko产生真正的null表型,在筛选那些可被残留的低水平蛋白质表达所掩盖的较弱表型时有用,但不适合研究必需基因或药理学抑制。基因产物的药物抑制很少是绝对的,因此基因表达的部分敲除而非完全敲除将更好地模拟药物的作用。

在探测基因激活突变在生物学和疾病中的作用时,CRISPR-ko的能力也往往受到限制,因为它只能解决功能丧失的影响。由于基因在癌症期间经常被激活(比如KRAS和BRAF),因此CRISPRa在研究疾病的分子病理学上具有巨大潜力,也有助于人们研究由功能获得事件而引起的耐药性。

科学家现在也可以选择将CRISPR-ko筛选与CRISPRi或CRISPRa结合使用。这些实验同时进行,不但节省了大量的时间,再加上这些方法是一脉相承的,这可以大大增加两次筛选所鉴定出hit的可信度。此外,不同的筛选过程还可能鉴定不同的hit,从而不断扩大科学家可探索的潜在靶点库。

(作者:Lucy Thorne博士 / 生物通编译)

相关文献

1. Genga, R. M. J. et al. Single-Cell RNA-Sequencing-Based CRISPRi Screening Resolves Molecular Drivers of Early Human Endoderm Development. Cell Reports 27, 708-718.e10 (2019).

2. Bester, A. C. et al. An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance. Cell 173, 649-664.e20 (2018).

3. Konermann, S. et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature 517, 583–8 (2015).

4. Yang, J. et al. Genome-Scale CRISPRa Screen Identifies Novel Factors for Cellular Reprogramming. Stem Cell Reports 12, 757–771 (2019).

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