潘道生物DNA甲基化活检黑科技或助“滴血”测癌成为现实

癌症是威胁人类健康的重要疾病，癌症早筛对于癌症的预防和治疗意义重大。DNA甲基化作为癌症早期筛查的生物标志物[1]，在早期癌症检测的灵敏度、准确性、成本效益以及区分癌种等方面都有巨大的发展潜力，为未来癌症早筛及癌种诊断的非侵入性检测带来希望。而在癌症甲基化研究中。如何更快速、更低价、更灵敏、更精准地获取特定基因片段上准确的甲基化信息，一直是表观科研工作者的持续关注点。

为了解决这一难题，建立一个适合临床使用的DNA甲基化检测方法，对各种方法分析DNA甲基化的效果进行深度评估。潘道科技自主研发了SmartCap Methyl -Seq技术（以下简称SCMS），该技术使用微量（低至10ng，一滴血约含200~300ng）的DNA即可对目标区域甲基化进行捕获测序，且成本远低于市场常规捕获技术。通过评估多种方法分析DNA甲基化的效果，潘道科技的SCMS测序技术表现优良，为致力靶向DNA甲基化生物标志物研究的科研院所、医院和公司提供有力的研究工具。

1. DNA甲基化与肿瘤发生的关系
DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，胞嘧啶甲基化（5-mC）在改变基因的时空表达、染色质的重塑[2]、细胞分化、疾病发生等扮演着重要作用。DNA甲基化水平变化，包括CpG岛局部的高甲基化和基因组DNA低甲基化状态的改变[3]，都可能导致细胞功能发生改变，进一步导致细胞癌变。

 

图1. 肿瘤生成中的DNA甲基化改变模式 (取自Esteller M，Nat Rev Genet 2007, 8(4):286-298)

2. 现有DNA甲基化检测技术局限性 
临床甲基化检测主要应用甲基化特异性PCR（Q-MSP）技术，其局限性主要有灵敏度低且只能进行定性分析，通量小。结合PCR和亚硫酸盐转化进行sanger测序作为一代DNA甲基化测序的“金标准”，其不足之处在于仅能检测少量基因座、低通量、成本高 [2]。
杂交捕获代表技术有Illumina的基因分型芯片EPIC 850K（Methylation Array）和罗氏为代表的的TBS液相捕获SeqCap Epi系列方案。然而，亚硫酸盐转化联合基因捕获方法仍然存在一些不足：1.亚硫酸盐转化：损伤和降解DNA[4]，造成DNA片段化和丢失，样本高起始量（ug级）；2.亚硫酸盐文库存在明显的GC偏向性。3.杂交捕获富集技术：检测流程复杂，依靠多仪器设备、检测周期长、价格昂贵，限制了其在液体活检中的运用[5]。

3. SCMS技术介绍
为了克服上述问题，潘道科技通过技术研发及自主核心算法开发，现推出专注临床甲基化应用的SmartCap Methyl -Seq技术（简称SCMS技术），具有捕获覆盖均一性好，起始量低至10ng，成本低，灵敏度高的特点。
SCMS技术流程：见图2。
 

图 2  SCMS检测流程

通过在不同条件下测试SCMS，结果显示，与TBS测序相比，其能够更均匀低覆盖CpG岛和目标区域片段，并且更好检测CpG位点信息。

SCMS采用全新活性蛋白转化技术取代亚硫酸盐处理，减少了DNA损伤，保持了片段完整性，同时降低了GC偏向性，再结合潘道研发的多重PCR扩增甲基化片段捕获核心技术，去除了Dimer的干扰，可同时实现多个基因甲基化DMR同时检测，基于该技术能够产生高质量的NGS文库，实现5mC高至1000X以上深度的可靠检测，最低仅需10 ng基因组DNA起始量，可应用于cfDNA检测等液体活检领域。

4. SCMS技术特点：
1.）技术应用更灵活：为客户提供个性化DNA甲基化Panel定制服务，支持不限物种的多基因联合检测；
2.）检测结果更准确：创新的胞嘧啶转化方法，彻底改变了传统BS（亚硫酸盐）技术对DNA的损伤，更完整的保存了DNA的多样性，检测结果更为准确可靠。
3.）检测区域更大：自主研发的多重扩增体系，可完成几十K到几百K区域的甲基化区域检测，，并达到单碱基分辨率，可应用于泛癌种筛查项目。
4.)靶向基因覆盖更均匀：探针设计的核心算法，避免了Dimer产生，结合Dimer去除技术，提高了数据利用率和覆盖均一性

 

图 3  TBS和SCMS检测技术数据利用率对比图

 
图 4  TBS和SCMS检测技术覆盖度对比

5.）DNA起始量更低：10ng起始量，使用少量石蜡切片即可检测，同时可检测外周血中频率极低的ctDNA中甲基化水平，使多基因联合早期筛查与预后实时监测成为可能。

 

图 5   TBS和SCMS检测技术起始量对比

6.）性价比更高：仅需市场捕获测序三分之一的价格便可对大规模样本进行科研或临床测试，对有甲基化多基因联合检测的科研工作者来说是非常好的技术方案。

 

图6   TBS和SCMS检测技术价格对比

5. SCMS的应用方向
目前，多基因联合检测已成必然趋势[7]，潘道科技SCMS产品突破技术局限性，打造了低成本、低起始量，高灵活度，高准确性的检测方案，应用方向有：1.）肿瘤早期筛查panel开发，泛癌种筛查[8-9]；
2.）癌症研究，如癌症表观药物研发、寻找癌症预后标志物（Biomarker）等[10]；3.）科研服务，如标志物筛查、胚胎发育及组织分化筛查、表观调控机制等[8]。

6. 参考案例
亚硫酸氢盐扩增子测序技术定量检测EBV相关鼻咽癌候选基因的DNA甲基化进行鼻咽癌筛查的研究[11]
Quantitation of DNA methylation in Epstein-Barr virus–associated nasopharyngeal carcinoma by bisulfite amplicon sequencing
本文采用亚硫酸盐扩增测序（BAS）技术对9个鼻咽癌组织（NPC）和9个非癌鼻炎上皮组织（NNE ）样本中的7个候选基因甲基化率进行定量分析，结果显示7个候选基因在NPC中显示出显著高于NNE组织的甲基化率，比率（NPC / NNE）按降序顺序如下：ITGA4 > RERG > ZNF671 > SHISA3 > ZNF549 > CR2 > RRAD。并且，ITGA4，RERG和ZNF671的甲基化水平可以区分NPC患者和NNE受试者。如下图7为候选基因ITGA4甲基化水平在NPC和NNE样品中存在明显差异，

 

图7  NPC和NNE候选基因ITGA4甲基化率分析

图8为关键候选基因ITGA4、RERG和ZNF671甲基化率可视化展示，该检测能够一目了然地区分NNE和NPC甲基化状态差异。

 
图8  NPC和NNE候选基因ITGA4、RERG和ZNF671甲基化率可视化展示

DNA甲基化生物标志物在癌症早筛、肿瘤预后标记筛查等方向应用前景广阔。
潘道科技提供SCMS技术，相对于文章中的BAS技术进行了进一步优化升级，在样品起始量，覆盖均一性及可检测区域方面等性能上均有较大提升。目前潘道科技已与合作医院共同针对肿瘤基因热点甲基化突变区域进行临床转化试验，为合作方提供领先的甲基化检测Panel服务及NGS检测服务。

7. 临床科研项目招募：
如果您同样致力于早期分子检测技术在临床上的转化应用，同样关注肿瘤早筛，来加入我们吧！潘道科技为您提供业内领先的甲基化检测技术平台，共同推动国内肿瘤早筛技术的发展和临床转化，为此，潘道科技面向广大临床科研工作者进行项目招募活动，具体如下:

项目类型 基于多基因甲基化联合检测的肿瘤早期筛查及预后治疗相关研发项目
项目目的 筛查中国人群特异的肿瘤关键甲基化Biomarker，并应用于液体活检领域及临床转化工作。
检测范围 检测候选基因数10-200个
活动内容 潘道科技分担一定比例的项目费用，科技成果技术平台共享，具体根据项目情况确定合作细节

基于SCMS技术展开泛癌种筛查科研项目招募报名啦，关注“潘道科技”点击报名链接或扫描下方二维码，即可报名参加活动！
 
潘道生物，专注于超早期分子检测技术在疾病筛查和诊断领域的转化应用，其旗下潘道科技开发技术覆盖了表观组学各个前沿研究领域，致力于成为全球表观遗传学研究机构的最佳科技合作伙伴。

参考文献
[1].Shen SY, et al. Sensitive tumour detection and classification using plasma cell-free DNA methylomes. Nature. 2018 Nov;563(7732):579-583.
[2].Urich MA, Nery JR, et al. MethylC-seq Library Preparation for base-resolution whole-genome
Bisulfite sequencing. Nat Protoc. 2015 Mar;10(3):475-83.
[3].Esteller M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nat Rev Genet. 2007 Apr;8(4):286-98.
[4].Grunau, C., Clark, S. J. & Rosenthal, A. Bisulfte genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters.Nucleic Acids Res.29, E65 (2001).
[5].Shu Yi Shen, et al. Sensitive tumour detection and classification using plasma cell-free DNA methylomes. Naturevolume 563, pages579–583 (2018).
[6].Kohli RM, Zhang Y. TET enzymes, TDG and the dynamics of DNA demethylation. Nature. 2013 Oct 24;502(7472):472-9.
[7].Gyparaki MT, et al. DNA methylation biomarkers as diagnostic and prognostic tools in colorectal cancer. J Mol Med (Berl). 2013 Nov;91(11):1249-56.
[8].Dor Y, Cedar H. Principles of DNA methylation and their implications for biology and medicine. Lancet. 2018 Sep 1;392(10149):777-786.
[9]Guo S, Diep D, et al. Identification of methylation haplotype blocks aids in deconvolution of heterogeneous
tissuesamples and tumor tissue-of-origin mapping from plasma DNA. Nat Genet. 2017 Apr;49(4):635-642.
[10]. Bidisha Paul, et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Clin Epigenetics. 2015; 7: 112.
[11].Weilin Zhao, et al. Quantitation of DNA methylation in Epstein-Barr virus–associated nasopharyngeal carcinoma by bisulfite amplicon sequencing. BMC Cancervolume 17, Article number: 489 (2017) .