中外学者合作发表Science：beta2肾上腺素受体胞内别构激动剂的调控机制

　　

G蛋白偶联受体（GPCR）家族在人体中有800多个成员，在视觉，嗅觉，味觉，以及激素和神经递质的信号转导中发挥着重要的生理功能，同时也是关键的药物研发靶点。

来自清华大学医学院的Brian Kobilka教授研究组发表了题为“Mechanism of β2AR regulation by an intracellular positive allosteric modulator”的文章，首次报道了激活态的beta2肾上腺素受体（β2AR）同时结合正构激动剂BI167107和别构激动剂Cmpd-6FA的晶体结构。这项工作鉴定了一个新的G蛋白偶联受体（GPCR）别构调节位点，并发现了新的别构调节机制，为针对GPCR的别构药物研发提供了指导。

这一研究成果公布在Science杂志上，论文通讯作者为清Kobilka教授与杜克大学Robert Lefkowitz教授，第一作者为刘翔宇、Ali Masoudi和Alem W. Kahsai。

目前绝大多数的GPCR药物靶向其正构位点，即天然底物结合的位点。正构位点在不同亚型的GPCR之间保守性较高，以致正构药物常存在亚型选择性较差的问题。别构调节物指的是不结合在GPCR正构底物结合位点的小分子化合物。其结合位置通常保守性较低，因此有可能具有更好的选择性。近年来，不少GPCR结合别构调节物的结构被报道出来。但是这些结构多数报道的是别构拮抗剂，它们将GPCR稳定在非激活状态。在本工作发表之前，仅有一个激活态GPCR结合小分子别构激动剂的结构被发表，即Brian Kobilka 教授在斯坦福大学研究组于2013年发表的激活态M2乙酰胆碱受体结合别构激动剂LY2119620的结构(Kruse et al., 2013)。 

Beta2肾上腺素受体属于 GPCR家族，在心肺系统中起重要调节作用。Beta2肾上腺素受体的配体，如beta阻滞剂（beta-blocker）和beta激动剂（beta-agonist），是常用的治疗心血管和呼吸道疾病的临床药物。在2017年，Brian Kobilka教授在清华大学医学院的研究组和杜克大学Robert Lefkowitz教授研究组合作在《自然》发文报道了Beta2肾上腺素受体结合首个胞内别构拮抗剂Cmpd-15的结构(Liu et al., 2017)。近期Robert Lefkowitz教授研究组通过DNA编码的小分子库筛选发现另一个小分子化合物Cmpd-6对beta2肾上腺素受体具有别构激动剂的活性(Ahn et al., 2018)。其能提高beta2肾上腺素受体对正构激动剂的亲和力，并且能与下游信号传导蛋白如G蛋白和arrestin协同作用，介导下游信号的传导。 

Brian Kobilka教授研究组和Robert Lefkowitz教授研究组合作，尝试利用蛋白质晶体学的手段获得激活态β2AR与Cmpd-6的复合物结构。然而初期的多次尝试都无法检测到Cmpd-6的电子密度。研究人员分析认为这是由于Cmpd-6溶解度较低，且亲和力较弱（uM级别），导致在晶体里面Cmpd-6的占有率较低，无法检测到电子密度。

为了解决这个问题，Robert Lefkowitz教授研究组在Cmpd-6上引入乙酸基团获得溶解度更高的衍生物Cmpd-6FA。Brian Kobilka研究组发现在较高沉淀剂PEG400浓度下Cmpd-6FA溶解度比较高，并经过一系列的晶体筛选和优化，成功在高PEG400浓度的条件下获得了激活态β2AR的晶体。最终在一个添加了3 mM Cmpd-6FA的结晶条件下收到了3.2埃的晶体数据，并且观测到了属于Cmpd-6FA的电子密度。Cmpd-6FA结合在跨膜螺旋2、3、4和第二胞内环（ICL2）形成的结合口袋里。

有趣的是，β2AR的第二胞内环在非激活态下是无规卷曲的结构，在激活态下是alpha螺旋结构。而Cmpd-6FA的结合稳定了其alpha螺旋结构。一方面，这有助于β2AR与下游Gs蛋白的结合。另一方面，为了形成第二胞内环的螺旋结构，β2AR的跨膜螺旋3（TM3）需要向内移动大约3埃，螺旋3的内移引起跨膜螺旋5和6（TM5和TM6）的外移，而后者是GPCR激活态的标志性构象。因此，尽管Cmpd-6FA结合在胞内的位置，它促使β2AR更倾向于处在激活状态，进而影响结合在β2AR胞外口袋的正构激动剂的亲和力。这一机理不同于之前报道的LY2119620影响M2乙酰胆碱受体的机理。LY2119620结合在M2乙酰胆碱受体的胞外口袋直接阻止正构激动剂的解离。

研究人员设计了一系列的Cmpd-6的衍生物，并测试了其活性。其结果与结构模型相互支持。Cmpd-6对于β2AR具有亚型选择性，它能显著提高β2AR对于正构激动剂的亲和力，而对同一家族的β1AR影响很小。分析表明在参与结合Cmpd-6的14个氨基酸中，只有7个在β2AR和β1AR之间是一样的。当把β1AR结合位点上的氨基酸突变成和β2AR一样时，Cmpd-6对β1AR也有较强的别构激动剂活性。这一突变实验进一步验证了结构模型。

Cmpd-6的别构位置可能普遍存在于其他GPCR中。该位置和别构激动剂AP8结合游离脂肪酸受体GPR40的位置有部分重合(Lu et al., 2017)。另外近期有研究组利用突变实验鉴定出多巴胺受体D1R的别构激动剂DETQ可能结合在其第二胞内环(Wang et al., 2018)。本工作鉴定出来的Cmpd-6结合模型可能用于指导其他GPCR的别构激动剂的设计。

 

参考文献：

https://science.sciencemag.org/content/364/6447/1283

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