靶向富集:满足你不同的测序需求

【字体: 时间:2019年08月20日 来源:生物通

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  顾名思义,靶向富集(target enrichment)是扩增样品中感兴趣的一部分基因,从而提高测序的信噪比。

新一代测序(NGS)涵盖了许许多多的领域和应用。人们通常将其分为全基因组测序和靶向测序,大致对应于“科研”和“应用”的范畴。靶向测序试图从数百万条序列中获取不同的组合,因此离不开富集步骤。

在富集过程中,用户可选择的方法不少。杂交捕获方法使用了与感兴趣的目标互补的探针,而基于扩增子的方法依赖多重PCR反应。选择性环化(又名分子倒置探针)则提供了第三种选择。

顾名思义,靶向富集(target enrichment)是扩增样品中感兴趣的一部分基因,从而提高测序的信噪比。

靶向富集面临的挑战

New England Biolabs(NEB)的业务开发经理Andrew Barry解释说,那些需要富集的应用本身就很苛刻。“这些应用往往像大海捞针,而且需要非常高的覆盖深度,或者从干扰性的宿主DNA中寻找特定序列,这是全基因组测序难以应对的。”

Barry引用了从游离肿瘤DNA中寻找体细胞变异的例子。癌症患者的血液样本中不仅含有低频率的体细胞变异,还含有大量的“健康”DNA,而研究人员的任务就是寻找那少得可怜的突变。

然而,“富集过程本身也引入了不确定性。对于扩增子方法,扩增也许会引入假阳性,而基于捕获的方法分离出感兴趣的目标,同时将DNA暴露在严苛的温度和试剂之下。”

NGS样品制备领域的开发人员正在努力克服这些挑战,例如引入分子计数策略来避免假阳性。他们在富集之前用分子条形码标记原始的DNA样本。Barry认为,这种策略很有希望,“它既保留了原始DNA的完整性,又纠正了样品制备下游引入的错误。”

NEB的做法是尽量维持样本的保真度,同时从那些低丰度或受到污染的样本中提取出尽可能多的信息。“在某些情况下,人们可以在靶向富集之前使用我们的NEBNext FFPE DNA修复混合液,以便修复组织固定过程中引入的错误,”Barry解释说。它由多种酶按照一定的配方混合而成,可以用来修复FFPE DNA样本。

NEBNext Microbiome DNA Enrichment kit则利用细菌DNA甲基化程度较低的情况,将细菌DNA与人类DNA分离,从而达到富集微生物DNA的目的。“我们还有NEBNext Direct(富集产品),它在扩增之前直接富集基因组DNA,采用温和的方法进行捕获,并利用酶法来去除脱靶序列,以达到超高的特异性,同时保持原始样本的完整性,”Barry谈道。

定制化的产品更受欢迎

Twist Bioscience的CEO Emily Leproust博士表示,靶向富集出现差异的主要原因之一是富集序列的不一致。“通常,目标区域内的序列捕获是不均匀的,导致某些不常见的变异代表性不足,而这些恰恰是感兴趣的区域。因此,需要更高的测序深度来捕获这些变异,这又降低了靶向富集的成本效益,”她说。

她认为,另一个值得关注的问题是定制靶向富集产品所需的时间。从小规模试点到大规模实施,这往往需要几个月的时间。“科学家认为,定制靶向富集不但昂贵,而且耗时,这使得他们不得不选择固定panel,或选择全外显子组测序。”

不过,随着我们对基因组学的理解不断加深,外显子组之外也发现了关键的调控区域。“他们希望能够同时了解所有信息。创建自定义的panel来富集非外显子内容或创建更小规模的panel,能够更快地实现转化研究的应用,”Leproust说。

Twist去年推出了靶向富集产品线,并发布了Twist Human Core Exome Kit和Twist Custom Panel。除了Twist Human Core Exome Kit,Twist还提供了文库制备组分,并继续扩展人类和非人类物种的固定panel。Twist Custom Panel则实现了快速的panel定制和优化。

LeProust博士认为,尽管靶向富集仍然存在挑战,但通过高效精确的DNA合成,设计高效的探针以及精确的合成,可确保每个探针高效地发挥作用,从而完成最高质量的捕获反应。

NGS样本是不断变化的,而捕获对象同样在不断变化,这意味着靶向富集将成为测序人员的首要任务,特别是那些开发医学诊断检测的人员。

“因此,我认为在靶向富集上不会有‘放之四海而皆准’的方法,”Barry补充说。“不同类型的研究在测序上都有不同的需求。根据样本来源和丰度的不同,以及研究目标的不同,这可能会有很大差异。”

LeProust也认为,现成的富集策略并不是可行的选择方案。“研究人员希望快速创建定制panel,并快速更替这些产品。”例如,Twist可以扩展的寡核苷酸合成平台能够生产高性能的探针,用于试验阶段和大规模使用时的NGS靶向富集。据这家公司介绍,这一时间远远低于典型的定制panel设计。

(作者:Angelo DePalma / 生物通编译)

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