NGS文库制备：从手动到自动的转换

万事开头难，对新一代测序（NGS）而言也不例外。文库制备就是NGS流程中重要的第一步。以往这是一个步骤繁多的过程，费时又费力，目前已经有了很大改进。不过大家仍然不可以掉以轻心，因为样品的质量将决定测序的结果。正所谓“garbage in, garbage out（无用输入，无用输出）”。

最近，许多公司都推出了适用于NGS文库制备的试剂盒，可简化这个繁冗的过程。许多试剂盒都与自动化设备兼容。本文将介绍一些新品，并顺带提提转换到自动化文库制备的好处。

各式各样的试剂盒

NGS文库制备的意义在于，这一步将DNA或RNA样品转化为NGS测序仪可以读取的形式。它的具体过程是将核酸打断成较小的片段，然后在片段的两端连上接头序列。有时还会添加独特的条形码，相当于给样品添加索引，这对于高通量测序特别重要。

目前多家公司都提供样品制备试剂盒，有些适合自动化，有些能够添加索引，而有些则针对特定类型的样品或核酸。比如，PerkinElmer为NGS文库制备提供了一个完整流程，包括液体处理设备、与自动化兼容的DNA/RNA文库制备试剂盒，以及质量控制产品。NEB的NEBNext系列文库制备试剂盒也支持多种类型的样品和核酸。

安捷伦提供的试剂盒也与他们的两个自动化NGS文库制备平台兼容。SureSelect XT Low Input、XT和XT2试剂盒与Bravo NGS工作站兼容，而SureSelect XT HS试剂盒与Magnis平台兼容。Bravo NGS工作站是基于Bravo自动化液体处理平台构建的，已预设文库制备和富集的操作方案。SureSelect XT Low Input是为完整或降解的FFPE样品优化的。SureSelect XT试剂盒支持文库的捕获后混合，而SureSelect XT2试剂盒实现了文库的捕获前混合。

Magnis系统则是安捷伦最新发布的全自动文库制备平台。它能够处理完整或降解的FFPE样品，上样量低至10 ng。此系统能够通过条形码自动检测试剂是否正确放置，并具有自检和优化功能，操作简单，即使没有经验也能轻松上手。它与SureSelect XT HS试剂盒兼容。

在制备NGS文库的过程中，选择DNA或RNA片段的大小是重要的一步。多家公司都提供了片段长度筛选的工具，比如MACHEREY-NAGEL的NucleoMag® NGS核酸纯化及片段筛选磁珠。“我们的磁珠可以用于市场上的各种文库制备试剂盒，也兼容各种自动化平台，”MACHEREY-NAGEL的产品经理Marko Gogala谈道。“它的优势在于灵活性，以及能够与现有的手动和自动流程轻松整合。”

转换到自动化

从手动制备转换到自动制备，这里面的好处很多。自动化文库制备更快速、更高效，且不容易发生人为错误，不容易受到污染，结果一致性更高。与自动质量控制（QC）检测相结合还可以优化实验流程。不过，在转换过程中须注意以下几点。

Gogala建议大家使用开放的自动化平台，而不是封闭的。封闭平台的价格可能比较低，但消耗品的价格可能会越来越贵。“在选择开放平台时，用户可以保持选项的开放性，将各个供应商的最佳方案结合使用，”他说。“此外，在出现交付瓶颈或方案更改的情况下，开放平台往往更容易适应。”

安捷伦的高级营销总监Viresh Patel则认为，在转换到自动化方案时应考虑样品数量。比如，Bravo NGS平台更适合高通量实验室，因为它一次可以处理96个样品。“对于中低通量的实验室，Magnis可能是更好的选择，因为它一次可处理8个样品，”他说。自动化水平也是考虑因素。“如果你想要一个全自动的流程，那么Magnis系统是理想之选，因为它是一键式的无人值守系统，”Patel指出。

自动化流程的优化

虽然实现了自动化的跨越，但千万别以为就一劳永逸了，您还需要考虑如何更好地优化实验方案。“优化是关键，并非所有的工作都是以相同的方式完成的，”NEB的NGS产品经理Fiona Stewart说。“移液操作、孵育温度和操作时机可能都需要悉心优化，以确保自动化结果与手动获得的结果相匹配。”

质量控制也是优化测序结果的另一个重要工具。“为了获得最佳的结果，在几个阶段需要进行QC，包括原材料阶段、中间步骤和最终文库，”Patel说。安捷伦提供一些全自动电泳仪，包括Fragment Analyzer、TapeStation和Femto Pulse系统，适用于原材料的QC。这些工具可以根据质量对FFPE或降解的DNA进行评分。

PerkinElmer的新一代测序主管Arvind Kothandaraman指出，强烈建议在测序前检查NGS文库的质量和数量。“文库质量是NGS的关键因素，因为质量不佳的文库会造成结果偏差，并影响读取的可靠性和重复性，”他说。

利用电泳图来观察文库，可以了解文库大小以及接头二聚体的相对丰富。文库也可以通过荧光分析或qPCR来快速定量。他补充说，尽管qPCR检测更费时费力，但“它们确保了最准确的文库定量，因为只有双重连接的分子才会被测定。”

考虑到文库制备的重要性，在测序开始之前花点时间来选择合适的产品，并优化制备的过程，这一切都是相当值得的。

（作者：Caitlin Smith / 生物通编译）