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动物用siRNA体内实验常见问题解答及实验案例

【字体: 时间:2020年01月09日 来源:锐博生物

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  我们应该如何设计动物实验方案?如果自己时间紧任务重,希望快速得到接近临床意义的实验结果,该选择化学合成的siRNA呢,还是用慢病毒或腺病毒类shRNA?今天,锐博小编就siRNA动物实验的常见的问题进行汇总与解答,最后分享一篇in vivo siRNA的案例。

当您完成了细胞筛选及功能实验之后,通常下一步会开展动物实验,而动物实验(Animal Experiments or In Vivo Study)经常是通往高分文章的必经之路。那么,我们应该如何设计动物实验方案?如果自己时间紧任务重,希望快速得到接近临床意义的实验结果,该选择化学合成的siRNA呢,还是用慢病毒或腺病毒类shRNA?今天,锐博小编就siRNA动物实验的常见的问题进行汇总与解答,最后分享一篇in vivo siRNA的案例。

 
锐博生物动物实验整体服务项目一览图

动物用siRNA常见问题与解答

Q1:化学合成siRNA和病毒类shRNA,到底该选哪一种呢?

答:如果您希望以更加经济、安全和在更短实验周期内得到接近临床意义的实验结果,我们推荐您采用化学合成的in vivo siRNA。原因有:
1. 实验周期更短:化合合成siRNA实验操作简单,属于即用型体系,提交合成需求之后7-15天就可以打动物;而病毒类shRNA需要构建和筛选稳转细胞株,一般需要2个月,存在突变风险;
2. 安全性更好:化学合成siRNA属于寡核苷酸物质,安全性好;而病毒类对实验室安全级别有要求,可能导致过感染,实验过程中对操作者也有潜在危害。
3. 经济性更高:siRNA单次制备费用低,可灵活选择修饰和定制规格;病毒类定制费用昂贵,且定制方面灵活性差。
4. 更接近临床意义:以注射成瘤裸鼠为例,用肿瘤细胞注射构建肿瘤模型,成瘤后再注射in vivo siRNA,观察瘤体生长速度减慢或缩小,局部和全身给药操作简单,可用于原位癌和转移癌等已经扩散的癌症;而用病毒构建稳转细胞株接种动物,直接注射病毒感染细胞,容易导致较强的细胞毒性、肝毒性,特别不适用于原发癌和转移癌等已经扩散的癌症。

Q2:动物用siRNA是否需要经过特殊修饰或制备?需要满足哪些条件?

答:由于动物体内生理环境非常复杂,动物用siRNA(又称in vivo siRNA)一般必须要提高其在体内的稳定性、半衰期、靶向性、纯度、药活性以及降低毒性等才可以用于体内实验,通常需要采用特殊的化学修饰或制备工艺以实现上述的目的。一般需要考虑三个因素:

① 稳定性:siRNA 易被酶降解,难以在体内持续发挥作用。
② 安全性:siRNA非特异作用引起“脱靶” 效应,外源RNA引发免疫反应。
③ 给药方式:必须提高 siRNA 生物利用度,有效作用于病变区域。

锐博生物采用自主专利siRNA化学修饰技术,原料全部采用高品质进口原料,通过严格质量检测控制体系,有效增强in vivo siRNA的稳定性,修饰不影响siRNA发挥作用,具有良好siRNA血清稳定性,并保持siRNA高效活性,更大限度降低siRNA对实验动物的毒性,最大限度满足给药要求,有效提高in vivo siRNA生物利用度,每批次质量均可溯源和提供完整的质量文件。

Q3:动物实验用的siRNA有Standard in vivo或in vivo,PAGE in vivo,HPLC in vivo,三者有什么区别,该如何选择?

答:根据具体情况选择,三者均是按照动物实验in vivo标准处理,一般通过反向(Na+)离子交换、动物级别去盐、滤菌、去内毒素等处理工艺,standard in vivo或in vivo的全长RNA含量不低于80%,适用于普通的动物实验,费用相对经济;PAGE/HPLC in vivo是在PAGE/HPLC严格的纯化之后再经过in vivo处理,PAGE/HPLC的全长RNA含量不低于90%,适用于更高要求的动物实验,费用相对昂贵。

Q4:siRNA针对不同的器官如何给药?

答:给药方法大致分为系统给药(如静脉给药、腹腔给药等)和局部给药(如皮下注射,玻璃体给药,鞘内给药等)。首先需要根据动物模型和实验方案,确定给药量和给药次数,然后计算出实验所需的总用量。需要根据不同的器官来选择给药方法,而给药量因不同给药方法和实验目的而异。如肝脏、肾脏、肌肉等常用静脉注射(系统给药);而皮下肿瘤则常用到瘤内注射(局部给药)。


in vivo siRNA给药方式示意图
(如:口服、静脉注射、皮下注射、眼内注射、脑室内注射、肌肉注射、椎管内注射、皮内注射、淋巴腔注射、鼻腔注射、舌下注射、腹腔注射等)

口服给药:安全方便,经胃肠道吸收,这类化合物利用率最低;
腹腔给药:不存在胃肠道首过代谢,但依然存在肝脏首过代谢,生物利用率较高;
静脉给药:不存在吸收屏障和首过代谢屏障,生物利用度最高;
皮下注射和肌肉注射:经皮下和肌肉毛细管吸收,吸收没有静脉注射完全,但可避开胃肠道和肝脏首过代谢;
皮内注射:把siRNA药液注射入表皮和真皮之间,皮内注射吸收较慢;
脑内注射:精确注射药物进入大脑脑室或大脑特定组织,如海马体、黑质等,跳过药物吸收和血脑屏障,给药体积很小。

从生物利用度的角度,静脉给药最高,依次是静脉给药>腹腔>肌肉>皮下>口服。

Q5:给药的推荐量是多大?给药频率是多少?

答:对于in vivo siRNA,推荐系统给药每次注射5~20nmol/20g体重,局部给药则需每次注射1~5nmol/20g体重,给药频率往往是一周2~3次,还可以根据实验研究目的灵活调整给药方案。

Q6:局部给药的使用范围和作用效果如何?

答:局部给药(Local administration)的适用范围是浅表器官和组织,包括眼、肺、脑、肌肉、皮下组织、叶鞘组织等,是最直接最常用的一种导入方式,siRNA 导入效率较高,siRNA的用量少,锐博生物in vivo siRNA提供灵活的生产规格,原料全部采用高品质进口原料生产,采用严格工艺控制体系,质量均可溯源。

Q7:系统给药的使用范围和作用效果如何?

答:系统给药(Systemic administration)的适用范围是具有广泛的组织分布的器官,包括心、肝、肾、肺等,主要是那些无法通过局部给药方式到达的靶位,如深入的内脏器官和一些散在分布的靶位(如淋巴细胞,转移性肿瘤细胞等),一般使用系统注射方式,用量一般较大。锐博生物in vivo siRNA提供大规格定制,原料全部采用高品质进口原料生产,采用严格的工作衣控制体系,单批次可达公斤级冻干粉,在批次质量控制上更具优势。

Q8:如何观察检测in vivo siRNA在体内的分布?

答:通过标记上特殊荧光基团,能够准确分析动物模型中siRNA 给药情况并不断优化药物递送参数。荧光基团的发射光波长位于近红外波段,可显著降低体内自发荧光背景信号干扰。锐博生物为您提供Cy3/Cy5/FAM等荧光标记的in vivo siRNA,通过活体成像技术,即可清晰显示动物体内药物分布情况。

In vivo siRNA典型案例解析

这里分享一篇文章:癌细胞需要代谢适应和微环境重塑才能生存和发展,钙(Ca2+)通量和Ca2+依赖性信号传导在该过程中起着至关重要的作用,但其潜在机制尚未阐明。浙江大学生命科学学院林爱福课题组发表在Molecular Cell (IF:14.548)上的题为LncRNA CamK-A Regulates Ca2+-Signaling-Mediated Tumor Microenvironment Remodeling,该研究揭示了CamK-A通过激活Ca2+触发信号传导参与癌症微环境重塑的作用机制,证明了lncRNA作为Ca2+依赖性细胞信号传导重塑乳腺癌肿瘤微环境的新型调节因子,提供了潜在的生物标志物和癌症治疗靶点。

该研究中动物实验方法

研究人员通过小鼠皮下植入人乳腺患者肿瘤组织瘤构建人乳腺癌模型,然后将胆固醇修饰的CamK-A in vivo siRNA和对照siRNA(均购自锐博生物)稀释于水中,以20 mg/kg的剂量,通过局部给药注射到小鼠的乳腺癌肿瘤中,每3天注射1次,连续给药7周,分析肿瘤(H),生长(I)或体重(J)。

研究发现,下调CamK-A可显著降低VEGF的分泌和异种移植肿瘤生长,血管生成和巨噬细胞募集也显著受损。在PDX模型中,通过使用in vivo siRNA(购自锐博生物)敲降CamK-A同样可显著减少肿瘤生长、巨噬细胞募集和血管生成。表明CamK-A促进浸润的巨噬细胞募集、血管生成、肿瘤微环境重塑和癌症发展,突出其作为潜在治疗靶标的作用。

原文:Sang L, Ju H, Liu G, et al. LncRNA Camk-A regulates Ca2+-signaling-mediated tumor microenvironment remodeling[J]. Molecular cell, 2018, 72(1): 71-83. e7.

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