如何做好国自然课题的设计

在上一篇“如何做好国自然的规划”中跟大家分享了规划，其实也是我们科研生涯的规划。凡事，预则立，不预则废。获得不少人的认同。有临床医生来问，“我也懂得要做好规划，不能松懈，但具体应该怎么做呢，或者说，国自然的课题应该怎么去设计才能提高中标率呢？”

今天我们就来讨论国自然课题的设计。

一个国自然课题拿出来，从国自然的角度来说，至少两个评估角度。

一、是否为连续深入研究

“优先资助连续深入研究”这句话是写在国自然指南第一段话之中。其实是看申请人是否有前期工作基础，研究工作是否有延续性，是否在进行深入研究。另一个角度也是看，同一个课题，为什么给我资助，不给别人。因为我前期一直在做这个领域的研究工作，现在申请课题是为了拿到经费继续深入。

季博是复旦毕业的，在复旦工作了九年。有一次，复旦附属肿瘤医院有个年青医生拿了个未中标的青年基金来讨论。拿到后，看了5分钟，季博就说：“你这个课题是请高人指点过的”。答复：“是的，是医学院一个教授指导的课题”。“是的，从课题本身来说，如果按照这个设计进行实验，如果数据理想，是可以发表10分以上文章的“。那么，这么好的课题，为什么申请个青年基金都没有中标呢？因为，这个课题与申请人前期文章背景一点关系都没有，至少标书中没有体现出来。在这种情况下，评审人一看就知道是找高人指导的。申请人自己科研能力如何？给了资助能否完成好？都是疑问。这种情况下，按照国自然要求的”择优支持，优中选优“的原则，中标概率就很难有保障了。

这个点，每个人的情况都是不一样的，遇到具体问题的时候，可以找季博讨论。请专职科研人员，教授级别高手指导的课题，如果不中标，大部分原因在这个地方。

二、课题是否满足高分文章要求

国自然返回意见中“因项目本身原因，在某些方面尚有不足，今年未能给予资助“。其实就是这个点。
国自然课题设计要符合高分文章的要求。这个地方也是我们今天要着重讨论的地方。

季博的公众号中，绝大多数文章都是在讨论课题怎么设计，高分文章的课题怎么设计。公众号内也有专门的在线讲座在介绍这些点。

提炼总结一下：

1、完整性
临床基础研究课题假设“A基因通过B机制在C疾病中发挥D功能“。四要素。
研究内容三步骤，步骤一：临床相关性（A-C）；步骤二：功能（A-D）；步骤三：机制（A-B）。

2、机制深度
机制的深度，机制三大类，I类：分子相关性机制；II类：功能相关性机制；III类：直接互作机制。

3、机制热度
看B机制的热度，B机制发表文章的水平，以B机制衬托A基因的重要性。

4、创新性
这个是最重要的地方，临床基础研究课题最佳的创新是，“A基因在我所研究的临床问题中未见报道“。

课题成立的评价标准

1、创新性
A基因在所研究临床问题中未见报道。

2、临床相关性
在临床样品中，疾病样品与对照样品间，A基因存在差异。

3、功能
有差异的A基因，存在功能，这个功能与所研究临床问题的出现有关联。

OK，总结到此，如果有不清楚的，可以到公众号上查看具体文章或讲座的详细介绍。假设这些我们都做到了，足够了吗？

我们比对“课题自查要素“来看一下。

其实还要加一个，第一条，临床问题。所研究临床问题是否为该领域内的关注点。

以上是国自然课题设计的原则，其实也是高分文章课题设计的原则。如果您有不同的见解，我们可以切磋，相互学习补充。今天我们就以这些原则，来讨论国自然课题设计具体怎么做，才能确保我课题的中标率。

路径

一、临床问题

查高分文献，看看我所在科室涉及到的临床问题，哪些在发表高分文章，也就是说，高水平同行在关注。怎么算高分，如果是综合杂志，CNS为最佳。如果是专业杂志，I区杂志为佳。

看文献这一步，除了是寻找确定高水平同行关注的临床问题外，还有最重要的一个任务。总结明星基因。

高分文章中，也是这个假设“A基因通过B机制在C疾病中发挥D功能“，把这些高分文章中的A基因和B机制（基因和通路基因）汇总出来，就是我所研究领域，目前高水平同行新发现的结论。这些A基因就是我所研究领域，最新的明星基因，B机制是明星通路。

假设，在我所计划研究的临床问题中nature上刚发表一篇文章，我们把nature文章的A基因标记为X基因。B机制是个pathway，文章中讨论了Y1/Y2/Y3/Y4。其中，直接互作机制是X与Y1存在直接互作。互作后，通过Y2/Y3/Y4传递信号。

二、基因X的相关基因寻找

就是寻找与基因X存在关系的基因。两个方向

1、直接互作基因

比如X基因是蛋白编码基因，我们用X基因蛋白的抗体到细胞中做IP，IP下来的蛋白打质谱鉴定，这样子就获得了与X基因直接互作的蛋白list。假设为listM。（IP-MS技术）

寻找某个蛋白的直接互作蛋白，有很多技术方法，这里介绍的是IP-MS。您实验室如果有自己的成熟技术，也是OK的。

如果X基因是转录因子或预测可以结合DNA，那么就要做ChIP-seq，用X的ChIP级抗体进行IP拉DNA，把拉下来的DNA进行测序看是什么基因的序列。也会获得一个list。

如果X基因是非编码，那么就可以做RIP等实验拉和鉴定与其互作的蛋白或RNA或DNA。也会是一个list。
Anyway，上面假设的nature案例中的Y1会在这个list中出现。我们的目标是找其他的互作蛋白，这个新互作蛋白，可能是在X的上游，其结合X后激活X，导致X与Y1结合；也可能是其与X和Y1形成3元复合物。都可以。

2、下游基因

前面这些直接互作的研究技术，虽然有不少公司提供服务，但很多好的实验室，IP部分是自己做，样品交给公司进行质谱或测序。为啥呢？因为这个IP需要摸索条件，以前跟耶鲁大学一个教授讨论课题，他课题组就在看，不同的洗脱条件下，与X互作的蛋白有哪些。也就是不同亲和力的蛋白有哪些。而公司实验是规模化的，不会这么精细。

寻找直接互作蛋白，是经典的高分文章技术路径。但，并不是做了就一定成功。说不定最后验证出来的还是Y1。或者验证结果不理想。这时怎么办？因为一个蛋白的直接互作基因有哪些，这些直接互作基因中除了Y1还有其他的是与我所研究的临床问题是相关的呢？这个问题探索性很强。

为了提高成功率，还有一种做法。找X基因的下游。X基因与Y1互作，通过Y2/Y3/Y4传递信号，还有其他路径吗？或者Y2和Y3间是谁？Y3和Y4间是谁？Y4下游是谁？只要找到一个没有报道的，验证清楚，就是一个好的课题。

怎么做？

看一下nature中，体外细胞实验是怎么做的。比如是在细胞株中把X干扰后，做的功能。那么我们也在相同的细胞株中进行X干扰，先重复功能指标。如果OK。分成两组，干扰组和对照组，进行组学筛选。
做什么组学呢？

两类组学：

A、高低表达组学
比如RNA-seq、蛋白组。看X干扰后，有哪些基因和蛋白发生了量的改变。

B、修饰改变组学
细胞内信号传递，是通过修饰。做磷酸化蛋白组找磷酸化修饰改变、乙酰化蛋白组找乙酰化改变、糖基化蛋白组找糖基化改变等等。

一般来说，前面案例中，Y2/Y3的检测，大部分会是磷酸化检测，甚至Y1也是，如果X是激酶的话。当然，如果X是乙酰基转移酶，Y1要检测乙酰化改变。Y4这类靠下游的，也可能检测其修饰改变，也可能检测其量的改变。一般细胞内传递信息，最终是要体现到基因表达上，把基因表达出来干活去。

通过这些组学筛选，找到与X基因有关系的基因，也是一个list。

这一步，不管是通过什么路径找到的与X有关系的基因，我们总称为listM。

三、listM临床意义

对于做基础研究的专家来说，拿到listM后，就可以从中挖掘与D功能相关，未报道有创新性的基因了。这个基因找到，机制上探讨与X的关系。如果数据漂亮，也往nature投，如果nature不收，投science。如果还不收，就往20分以上找合适杂志投稿。这就是大部分研究领域中，nature和science有研究结论发表后，后续相同方向的研究成果是在20分以上的杂志。再过一年可能就只是10分以上了。

对我们做临床基础研究的人来说，现在还不能进入功能步骤。我们还需要看临床意义。

收集对应的临床样品，进行组学。大家注意，这里讨论的临床样品组学，不是为了这一个课题服务，也不是等看到nature文章之后再做。而是只要我们有样品，有经费，就可以把这些样品以组学信息收集起来。以组学数据的形式电子化保存。

做啥组学呢？比如我们做肿瘤研究。

1、基因组

癌和癌旁进行WES或WGS。汇集基因突变信息。

跟一位主任聊课题，“这个肿瘤上做的WES/WGS有很多了，我们还需要做吗？”

这句话，两个点。“做了很多”，说明在肿瘤研究领域，同行都认可需要找突变。“我们是否需要做？”，看目前的研究现状。大家认为是找得差不多了，还是说，还没有确定的结论。比如，某基因突变参与某肿瘤耐药，耐药病人该基因突变率为20%，那么还有80%结论是什么？如果不清楚，就需要继续研究。

再者，别人做得很多了，那么新药呢？在我们医院做临床试验或刚上市的药物呢？肿瘤耐药大家都知道会跟突变相关，只要我们有样品，赶紧上。现在做课题，创新性真的是抢出来的。

2、高低表达

临床样品，癌和癌旁，进行高低表达的组学，RNA-seq、蛋白组等。找表达改变差异。

3、修饰改变

临床样品，癌和癌旁，进行修饰改变的组学，磷酸化蛋白组、乙酰化蛋白组、泛素化蛋白组、糖基化蛋白组等。找修饰改变差异。

m6A算什么组学类型？算修饰改变类型。不过，m6A的writer、reader、eraser要到高低表达的组学中去找。具体可以查看“我的研究中可以做m6A吗”这篇文章。

Anyway，通过临床样品进行组学，我们筛选到差异基因，这群基因具有临床相关性，有临床意义。我们假设称为listN。

四、交集及创新性分析

可能大家都想到了，把listM和listN取交集，交集基因既具有临床相关性，也跟明星基因X存在关系。
是的，您想的是正确的。不过，“取交集“3个字，看上去很简单，实际生信分析也很简单。但实际情况会比较复杂，您listM是怎么来的，listN是怎么来的，如果交集了，交集基因故事怎么讲，这个是课题设计的范畴了，生信解决不了。

比如，listM是X基因的蛋白IP-MS的结合，是直接互作蛋白。ListN是WES中来的。那么就要问了，这个交集基因，在肿瘤中有突变，会影响其与X互作吗，这个影响对肿瘤的发生发展，侵袭转移，复发耐药等所研究的临床问题，可能的作用会是怎样？要有个假设的故事。后续做实验来验证这个假设。这就是课题设计范畴了。

其实这个交集分析，不简单。交集出来的基因，需要有个假设，才能指导后续的实验计划。

如果交集出来了，接着就评估创新性。比如交集出来了Y1，或者Y2/Y3/Y4，这几个都报道了，就不是我们想要的。

创新性评估两个点，a、交集基因在所研究临床问题中是否有报道。这个是核心创新。b、交集基因与X基因的关系是否有报道。如果没有报道过，创新性是最佳的。如果有报道，就复杂了，要看报道了什么内容，对我们课题的影响是什么。

五、功能筛选

有创新性的交集基因拿到后，如果您听了前面的在线讲座，就知道这一步很简单，做HCS功能筛选，把有功能的基因筛选出来。

到这个地方，我们就拿到了我课题的A基因，运气好的话，会有好几个A基因。这里的A基因，具有这么几个特征。

1、创新性
A基因在我所研究的临床问题中未见报道。且这个临床问题是领域内的关注点。（临床问题热点）
2、临床相关性
A基因在临床样品中，组间存在差异。有临床意义。
3、功能
A基因存在功能，这个功能与我所研究的临床问题相符。
4、机制热度
A基因与发表在nature上的X基因具有关系。A基因与X基因的关系探讨，就是我课题的B机制部分。
5、机制深度
如果A基因是从X基因的互作中交集出来的，那么我课题的机制就是直接互作机制。
如果A基因是从X基因的下游中交集出来的，这时要注意，如果要提升课题的高度，这里需要找A基因的直接互作机制，这个直接互作机制不一定是与X基因直接互作。可以是Y1/Y2/Y3/Y4，也可以是其他分子。遇到具体情况，需要根据具体内容进行分析规划。

大家看一下，这个路径拿到的A基因是不是符合前面我们讨论的国自然课题设计原则和高分文章课题设计要求。

由于篇幅所限，很多细节本文没有细化，大家可以参看前面的课题设计相关文章。如果有不清楚的，可以联系季博或者吉凯基因的科研顾问和业务员。

在“如何做好国自然的规划”这篇文章建议下，您做好规划；
在“如何做好国自然课题的设计“的建议下，做好每一步实验，把课题设计好。写好。

相信在这两篇文章建议的加持下，您付出的努力总会有好的回报。