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德国癌症研究中心推出全自动化蛋白质组学方案,Covaris聚焦超声为低量样本鉴定提供保障

【字体: 时间:2020年11月12日 来源:基因有限公司

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  德国癌症研究中心 Jeroen Krijgsveld 教授领衔的研究团队公布了如何通过无缝集成autoSP3技术与基于AFA聚焦超声的Covaris样品破碎仪来减少手工处理相关的样品制备问题,包括耗时、蛋白定量的不可重复性以及难以实现低量样本蛋白质组鉴定等。

样品制备是蛋白质组学研究中唯一依赖人工处理的环节,包括裂解、还原、烷基化、除盐及酶解等。为了减少人为的误差,无论是临床还是科学研究,全自动、高通量、标准化的工作流程对于处理来自不同来源的样本(包括新鲜冷冻组织、FFPE组织或血液)至关重要。

《Molecular Systems Biology》杂志近期刊载了一篇方法,由德国癌症研究中心(DKFZ)Jeroen Krijgsveld 教授领衔的研究团队公布了如何通过无缝集成 autoSP3 技术与基于AFA 聚焦超声的Covaris样品破碎仪来减少手工处理相关的样品制备问题,包括耗时、蛋白定量的不可重复性以及难以实现低量样本蛋白质组鉴定等。

早在2018年,Jeroen Krijgsveld 团队就在《Nature Protocols》上公开了基于顺磁珠的single-pot solid-phase-enhanced sample preparation,简写为SP3。根据该方法,在有机溶剂(>50% ACN或EtOH)诱导下,磁珠无差别结合并固定溶液中的蛋白质和多肽;在水性缓冲液中,蛋白质则从磁珠释放,然后被蛋白酶水解产生纯净的多肽,并可以直接注射到LCMS中进行分析。值得注意的是,该方法允许通过多次洗涤去除SDS和Triton X-100等去污剂而不影响蛋白得率。因此,高通量、快速\操作简单,兼容去污剂等特征使得SP3在各类样本中被广泛应用。

本文中,研究人员改进了这一方法,提出了autoSP3的方案。简单说,就是在一个液体工作站(Bravo liquid handling system,Agilent Technologies)上完成SP3的操作,直至提供可直接用于LCMS分析的多肽。值得注意的是,autoSP3不包含前期组织或者细胞的破碎,即从裂解物开始。

经验证,autoSP3展示了极好的可重复性。这在60个HeLa样本(平均变异系数仅为16.3%)和51个FFPE样本队列(平均CVs低于15%)中得到验证。表明从组织中得到多肽并通过LCMS分析所需的所有步骤都具有高度一致性。

同时,手动SP3的所有优点都在autoSP3中延续,包括处理含有洗涤剂的样品。能够清除洗涤剂(包括SDS)的能力为蛋白质提取方法的选择增加了很大的灵活性,尤其对于只能在SDS存在下才能有效提取的样品类型,例如FFPE组织。在文中,作者展示了加入1%和4% SDS后,新鲜组织和FFPE组织都能够高效裂解,并且可以通过autoSP3有效地去除洗涤剂,而无需在LCMS之前进一步除盐。

在灵敏度方面,autoSP3显示了从100个HeLa细胞样本量中可重复性的识别500个蛋白质的能力。这得益于自动化工作流程减少了技术可变性,而允许对生物学差异进行更深入的分析。提示autoSP3在稀有细胞类型蛋白质组分析的强大应用。

尽管上述结果证明了autoSP3的强大性能,但之前的组织裂解和还原/烷基化步骤是额外独立进行的。为了将所有步骤集成到一个工作流中,从而消除几乎所有的手动处理步骤,该方法中引进一台Covaris LE220R-plus聚焦超声仪,利用自适应聚焦声学(AFA)技术,通过向96孔板中的微小样本量(例如12-100 ul)输送高度可控的能量,来裂解组织和提取蛋白质。此外,AFA技术提高了DNA/染色质剪切的效率,更加有利于后续的autoSP3操作。

测试实验选用三种不同的动物新鲜冻存组织(心脏、肝脏、肾脏)以及HeLa细胞加在96 AFA tube TPX板中,分别加入75ul和12ul含有1% SDS的裂解液,之后用AFA超声处理。处理时间为5min/8个样品,96孔整板处理约1h。结果显示,每种组织中提取的蛋白质含量与所加样品量呈线性相关。蛋白质提取后,将96 AFA tube TPX板直接移到Bravo系统进行autoSP3,完成包括还原、烷基化、除盐、酶解和肽回收等步骤。接下来,对于随机选择的样品进行LCMS,结果显示从不同组织类型的五个重复样品中鉴定到的蛋白质数量高度重复。每种样本类型的CVs值统计结果表明,超过84%的定量蛋白质的CV<30%,中值变异系数为13.7%(心脏)、10.4%(肝脏)、12.0%(肾脏)和15.5%(HeLa细胞),反映了从组织裂解到生成MS数据的所有处理步骤的高度一致性。

总体来说,AFA聚焦超声和autoSP3的结合是一种非常有效的高通量自动化蛋白样本制备方法。完成96个样品制备仅需要3.5小时(超声破碎1小时,autoSP3 2.5小时)。这使得每个工作日可以由一位实验员以最少的实际操作时间处理两到三块板(或最多300个样品)。考虑到目前autoSP3的2.5小时中有1小时用于加热模块的升温和冷却(用于还原和烷基化),因此很容易想象如果使用更高效的装置,或者通过确定在较低温度下进行烷基化反应的条件,整个流程的速度将进一步加快。

参考文献
Müller T, Kalxdorf M, Longuespée R, Kazdal DN, Stenzinger A, Krijgsveld J. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Mol Syst Biol. 2020 Jan;16(1):e9111. doi: 10.15252/msb.20199111. PMID: 32129943; PMCID: PMC6966100.

基因有限公司作为 Covaris 中国区的合作伙伴和全国代理商,竭诚为您提供AFA技术的精彩应用,更多相关资料请联系基因有限公司相关人员或登录基因有限公司网站进行了解~

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