CRISPRi筛选解决代谢复杂性——揭示的生命的精准反击

　　

代谢系统缓冲环境变化的能力对微生物学家来说并不总是一个受欢迎的特性，因为它干扰代谢工程或阻止抗生素杀死细菌。

了解代谢稳健性的机制便是科学家们探索的一个课题。现在，一个大规模的CRISPRi平行筛查证明了大肠杆菌对酶敲除的代谢抵抗，多组学数据揭示了其背后的机制。未来，研究人员希望应用这些知识来建立更好的新陈代谢模型，从而使工业微生物的合理设计成为可能。

在自然栖息地，大肠杆菌等细菌面临着营养成分的不断变化，而在实验室条件下，它们也可以成为依靠葡萄糖等单一碳源生长的专家。要做到这一点，细菌的代谢网络必须从头合成所有的细胞构造块。这项任务要求代谢网络中数百个酶催化反应以正确的速度工作，并且没有任何反应意外地低于临界值。否则，网络中的单一瓶颈可能会造成泛滥的后果，并最终阻止菌落增长。

为了了解大肠杆菌如何完成这项任务，马克斯普朗克陆地微生物研究所的Hannes博士领导的研究人员应用了CRISPR干扰（CRISPRi）技术。通过诱导大肠杆菌代谢网络中每种蛋白质的敲除，他们创建了一个包含7177株菌株的CRISPRi文库。在一次联合竞争试验中，对文库进行深度测序，研究人员能够跟踪每个CRISPRi菌株14小时的适应度。这个巨大的平行CRISPR筛选（CRISPR screen）的结果有些令人惊讶。仅敲除代谢网络的七个关键基因（比如影响DNA合成的脱氧核苷酸的生物合成）就会立即造成强烈的适应性缺陷，相反，敲除几百个其他基因几乎没有影响。

Hannes Link博士解释说：“我们的结果表明大肠杆菌细胞具有非常高的代谢稳定性。一般来说，稳定性使生物体能够在外部和内部干扰的情况下生存，并且有不同的机制来调节它，例如反馈机制或裁员。在这种情况下，生物体总是处于一种权衡的状态：要么表现出高浓度的酶，这是昂贵的；要么是低浓度的酶，这会限制新陈代谢能力。对我们的研究人员来说，稳定性并不总是细菌的一个受欢迎的特性，例如在生物技术应用过程中，如果我们想用细菌来控制代谢，使化学物质过量产生。因此，了解大肠杆菌如何完成这项任务是很重要的。”

为了回答这个问题，研究小组测量了30个CRISPRi菌株的蛋白质组和代谢组。在一些菌株中，蛋白质组反应揭示了积极缓冲CRISPRi基因敲除的机制。例如，甲硫氨酸途径中同型半胱氨酸转甲基酶（MetE）的敲除引起了蛋氨酸途径中所有其他酶的代偿性上调。换言之，大肠杆菌细胞感觉到敲除导致蛋氨酸生物合成的瓶颈，然后在蛋氨酸途径周围产生非常精确和局部的反应。其他30个CRISPRi菌株显示了相似的缓冲机制，这些机制是惊人的特异性，但是否所有的代谢途径都配备了这样精确和局部的缓冲机制仍然是个未知数。因此，Link实验室目前正在创新质谱方法，以探测完整CRISPRi库的完全代谢。

这种综合方法为开发工业上有用的微生物创造了新的可能性，正如Hannes Link博士指出：“在未来，我们希望利用这些数据来构建动态和预测性的代谢模型。我们在当前的研究中使用了一个非常小的动态模型，但是建立更大的模型仍然是一个巨大的挑战。这样的模型可以让我们设计出在某种信号下停止生长的大肠杆菌细胞，然后将所有的代谢资源集中在合成所需的化学物质上。这种控制增长与生产过剩的脱钩将在代谢工程领域开辟新天地，并在工业生物技术中开辟新的应用领域。”

原文检索：Multi-omics Analysis of CRISPRi-Knockdowns Identifies Mechanisms that Buffer Decreases of Enzymes in E. coli Metabolism