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偶联抗体好难好费时间?用了这款“傻瓜式”神器,3步解决抗体偶联!

【字体: 时间:2020年12月16日 来源:

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  自行偶联标记一抗只需 3 步骤,20 分钟到3.5 小时,即标即用,超过 45 种标记可选!

纵有万千灯火红 却无一处枝头香

找抗体有时感觉就像在茫茫人海中寻人——找到合适的抗体不容易,找到合适标记的直标抗体更不容易——直标抗体应用虽越来越多也越来越受重视,可选择范围依然那么有限。有合适的抗体,却没有想要的标记,怎么办?定制太漫长,只争朝夕。只要找到合适的无标记纯化抗体就要赶快抓住——因为现在自行偶联标记一抗只需 3 步骤,20 分钟到3.5 小时,即标即用,超过 45 种标记可选——问题迎刃而解,“柳暗花明又一村”的感觉,有木有?
 
就算你现在能找到真爱抗体也一定要留意这金牌备胎——以备不时之需呀,谁保证你以后一定都能幸运找到所需呢?而且,不光标记抗体,你想偶联蛋白,多肽,想把寡核苷酸偶联到蛋白上,或者用磁珠标记、镧系元素标记、纳米金标记,也一样行。来,这等神器得用小本本记起来。
 

天下武功 唯快不破

没做过自行偶联标记一抗时,总以为好难好费时间,恨不得都托付给实验服务供应商代办,哪知有了 Abcam 的偶联一抗神器 Lightning - Link®,原来可以这么简单!


以 PE 偶联标记为例,只需要

Step 1
在纯化抗体中先加入修饰试剂(modifier)混匀
Step 2
把抗体加入到 PE 标记试剂冻干粉中,混匀,暗处室温孵育 3 小时
Step 3
最后加入淬灭剂(quencher)孵育 30 分钟(用于阻断少量剩余的游离基团)

抗体即可马上拿去用,不需再纯化或者脱盐了。艾玛,操作这么简单?简直“小菜一碟”好么?

要是想更快一点,当然可以。还有 Lightning - Link® Fast 系列可选,比如标记 Dylight® 550,Step 2 的暗处孵育只需 15 分钟,Step 3 的淬灭只需要 5 分钟即可使用了,简直快得不能更快、简单得不能更简单了!
 
没错,整个抗体标记反应在生理 pH 下进行,不会造成抗体聚集,在同一试管中完成,得到的偶联抗体通常可以直接使用而无需进一步纯化,无需顾虑标记后再纯化的抗体损耗,回收率接近 100%

Lightning-Link® 可以在无抗体损耗的情况下,快速生成偶联产物,一致性高,可重复性好,还适用于偶联其他蛋白或多肽。有不同规格可供选择,分别适用于从 10 µg - 100 mg 多种规模的抗体偶联标记。意不意外?惊不惊喜?
 

超过 45 种标记,只选最合适你的

Lightning - Link® 系列另一个特别赞的优点是提供 45 种标记可供选择,从常见的酶标记比如 HRP、AP 与 GO,生物素/链霉亲和素标记,到常见的荧光染料如 Alexa Fluor® 系列、Cy 系列、DyLight® 系列、Atto 系列、FITC、TexasRed、罗丹明,还有常见的荧光蛋白和串联染料如 PE,PerCP,APC 和多种串联组合,品种相当丰富,除此之外还有 Oligo 偶联、兼容  10X Genomic 的 5’ Feature Barcode 标记、金纳米颗粒标记(多种规格)、甚至还有多种镧系元素标记,磁珠标记,乳胶微珠颗粒偶联等等,简直太宝藏了。不过,不同的标记材料操作各有不同,比如要把 Oligo 偶联到抗体或者蛋白上,操作可就要稍微麻烦一点咯。
   
细节决定成败——那些要留意的

这么简单易用好用的神器,对起始材料有啥要注意吗?当然有的。
 
偶联标记的靶点是赖氨酸和蛋白质 N 端的胺基,因此适用于抗体、蛋白质、多肽和其他带有可用胺基的生物分子。


应使用纯化一抗

应该选择使用纯化一抗(purified)——也就是说,未经处理的血清或组织培养上清液不适合偶联。并且起始浓度要求在 1mg/mL 以上。要是浓度不够,可以选择抗体浓缩纯化试剂盒(Abcam Antibody Concentration And Clean-Up Kit ☞ab102778),这个采用 spin 形式的快速离心纯化柱,操作跟 Spin 柱纯化质粒一样简单快速。浓缩抗体的同时还可以除去原溶液中如 BSA、叠氮化物、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷等影响标记的成分。


需留意部分一抗缓冲液和添加剂

偶联过程中,赖氨酸基团和标记物之间会形成强共价键。有些一抗缓冲液和添加剂会干扰偶联反应或者与偶联反应产生竞争,需要特别留意。比如常见的 BSA,不超过 1% 的 BSA 对标记反应影响不大可以使用,但是超过 1% 的话会竞争性干扰并影响标记效率(市售抗体如添加 BSA 通常会标注浓度)。这时还可以选择去除 BSA 试剂盒(BSA Removal Kit, ☞ab173231)先纯化抗体。

叠氮化钠干扰偶联反应(市售纯化抗体如有添加叠氮化钠会标注),如果必须加则不应超过 0.1% 。其他可能干扰的常见组分包括甘氨酸,尿素,脯氨酸,精氨酸,谷胱甘肽,乙醇胺,DTT,巯基乙醇,50 mM 咪唑等等,具体要看试剂盒说明书,用上述的抗体浓缩纯化试剂盒可以除去大部分干扰物。对于腹水或全血中纯化抗体,可以考虑用蛋白 A 树脂结合体浓缩纯化试剂盒进行纯化。
 
缓冲液推荐 Hepes、MES、MOPS 和磷酸盐缓冲液或任何其他无胺缓冲液。20 mM Tris 缓冲液(不超过这浓度)也可以进行偶联反应,且偶联效率几乎不会降低。反应完成后,可以选择能兼容标记和抗体的任何缓冲液中稀释偶联抗体。建议缓冲液的 pH 值在 6.5 和 8.5 之间


注意偶联反应产物的保存条件

偶联反应所得的产物可以在 4°C 下保存 12-18 个月。由于抗体和染料之间的键是共价键而且非常稳定,所以偶联后抗体的稳定性取决于原抗体,如果原抗体本身可以在 4°C 下保存,则偶联抗体就可以在 4°C 下保存。长期保存仍建议添加抗菌剂和/或稳定剂(例如叠氮化物、BSA、甘油等)。一般所有偶联抗体都可以在添加 50% 甘油后,在 -20°C下保存 2 年。-20°C 下保存 APC 和 RPE 偶联抗体必须使用甘油。长期保存建议不进行稀释。这些常识不必多讲了。


用过的人都这么说

说得再好也不如用得好。这时候你一定已经满脑子疑问:讲了这么多,到底有没有人实际用过啊?最关键的是,标记出来的抗体用起来到底行不行啊?

上市没多久,已经有 750 余篇已发表论文中引用过这个 Lightning-Link® 试剂盒啦!


研究人员对 ab102918 R-PE 偶联试剂盒的评价:


“虽然标记抗体的量非常少(60 μg),但R-藻红蛋白偶联试剂盒非常便捷、有效。”

研究人员对 ab201800 Dylight 550 偶联试剂盒的评价:


“改善了小鼠抗小鼠免疫荧光染色的效果……Dylight® 550 快速偶联试剂盒(ab201800)标记的小鼠抗 CCX4 抗体(ab27591)”


研究人员对ab102884 FITC 偶联试剂盒的评价:


“该试剂盒可完美地应用于市售的一些纯净浓缩抗体!与先前首先完成细胞内染色再在流式细胞术中使用偶联二抗的方法相比,该试剂盒能够得出更好的结果。”

确实是好评如潮,有效的试剂是王道,能改善结果的试剂才是好试剂,这个 Lightning-Link® 是不是真的让你心动呀?有需要的赶紧行动起来,就算暂时用不上,也可以收藏本文,以备不时之需呦!

*注:Alexa Fluor®和 DyLight® 为赛默飞公司注册商标。

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