新冠肺炎核酸检测假阴性,症结在这里

【字体: 时间:2020年02月13日 来源:基因有限公司

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  到底是什么原因导致核酸检测结果假阴性如此之高?寻找问题的方向是否正确?现行解决办法是否有效?

最近几天,备受民众和媒体关心的问题之一就是新冠肺炎的病毒核酸检测假阴性。

的确,就目前的数据来看,疑似病例的病毒核酸检测假阴性颇高,对于真是新冠病毒感染的病人,阳性率也只有30%-50%。因此很多人认为核酸检测不靠谱,也有医生提出建议以CT影像学检查阳性代替病毒核酸检测阳性来确诊。但是目前病毒核酸检测仍然是确诊标准,这是为什么呢?

在《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(第五版)》中关于鉴别诊断是这样描述的:

“主要与流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、SARS冠状病毒等其他已知病毒性肺炎鉴别,与肺炎支原体、衣原体肺炎及细菌性肺炎等鉴别。此外,还要与非感染性疾病,如血管炎、皮肌炎和机化性肺炎等鉴别。”

由此可见,仅凭借CT影像学检查不能将新冠肺炎与以上病症有效鉴别,会存在误诊的情况,而误诊又会导致新的交叉感染。

因此,核酸检测目前仍然是最准确的诊断方法。

那么到底是什么原因导致核酸检测结果假阴性如此之高?
寻找问题的方向是否正确?
现行解决办法是否有效?

关于这些问题,网络上充斥着各种声音。

在发表我们的见解之前,我们先来简单回顾一下样本送检流程:医护人员采样——包装——运输至检测实验室——样本灭活——裂解——核酸提取——qPCR检测——出报告。

我们把这个流程划分为三个环节:采样及运输环节、核酸提取环节和qPCR检测环节。

任何一个环节存在一点问题,都会提高假阴性风险。现在我们分别来看每个环节可能产生假阴性的主要因素。

1、采样及运输环节

我们都知道下呼吸道样本含有病毒载量更多,但是由于采样不方便或者病人没有痰,现在采集的样本几乎都是上呼吸道样本,比如咽拭子。根据病人病程、医护人员取样操作的规范程度不同等原因,会出现采样量不均一问题,也就是量多量少的问题,采集的样本中病毒量少,假阴性的风险就高。

因此,在采样及运输环节,样本采集是一个主要因素

运输环节,目前的包装和运输条件全部使用国家CDC 标准,对于样本质量的保证和风险都是一致的,我们暂且不做讨论。

2、核酸提取环节

注意,这个环节从样本灭活开始,到获得样本中RNA结束。而且样本具有特殊性。

目前送检样本以咽拭子为主,极少量痰液。咽拭子擦取的是两腭弓、咽及扁桃体部位的分泌物,这种分泌物与痰液的共同特点是有黏度、蛋白多、不易液化,处理困难

如果有足量的样本,现有的核酸提取方法也不是问题(无非就是处理麻烦些,需要的样本量和试剂量比较大),问题就在于咽拭子和痰液本身就很难处理,而且采集的样本量可能还非常少。

对于核酸检测假阴性,现有观点主要考虑核酸纯化及qPCR,没有考虑更靠前的样本处理的重要性,比如出于对检测人员的安全防护,所有的样本在核酸提取之前都需要进行56℃,30分钟的灭活处理。新冠病毒是RNA病毒,这一步灭活在一定程度上会造成病毒核酸降解影响后续核酸提取的得率和质量,进而影响下游检测鉴定结果。

再比如样本的裂解,使用裂解液裂解属于化学法裂解,如果单纯是细胞,化学裂解的效果是有保障的,但是如果是咽拭子或痰液这类样本,化学裂解就很难裂解充分,导致病毒核酸释放不够,影响后续核酸提取得率(再是痕量样本,困难可想而知)。

因此,在核酸提取环节,针对咽拭子或痰液这种难处理且微量/痕量的样本,处理方式才是影响病毒核酸提取得率的最主要的因素

3、qPCR检测环节

首先我们需要明确的是,要有病毒核酸存在,qPCR才能检测出来。有专家在质疑检测试剂盒的质量以及检测手段,认为应该对不同厂商的试剂盒进行系统对比,我们赞成这个做法,因为不排除有试剂盒原料、引物设计、产品质控手段及产品批次间有差异。但是我们也要为大部分试剂盒生产厂家和仪器生厂商说句公道话:qPCR方法诞生于1996年,发展至今技术非常成熟,检测灵敏度可低至1个拷贝,是当今应用于临床的最先进的核酸分子诊断技术之一。

因此,在qPCR 检测环节,检测试剂盒是一个因素,还有一个影响因素是检测技术人员的技术水平。值得庆幸的是,这两个影响因素随着试剂盒质量和技术人员水平的不断提升正在逐渐减少。

经过总结,我们不难发现,在整个新冠肺炎样本进行核酸检测过程中,导致假阴性结果的主要因素有4个:1、样本采集;2、病毒核酸提取前的样本处理方法;3、检测试剂盒质量;4、操作人员水平。

我们前面说过了,3和4这两个因素一直在改善,目前和未来都不会成为最关键的因素。

经过前面讨论,现在最关键的影响因素已经浮出水面了,那就是样本采集和病毒核酸提取之前的样本处理方法。也就是说如果没有采集到样本或者没有提取到病毒的核酸分子,再牛的检测试剂盒结果也只能是阴性。

临床样本采集有先天的局限性,可以说有很大一部分的假阴性是因为只采集到一点点的带病毒样本,这一点点样本还有很多黏蛋白,很难裂解,想要提取到核酸还得能用于qPCR扩增可以说是非常困难的,假阴性的结果也变成情理之中了。

那么面对这一点点还很难处理的样本,我们就束手无策了吗?

每一份痕量珍贵的样本背后,都有一个亟待救治的患者,每一份检测报告的背后,都是不止一位检测工作者超过5个小时的风险操作。

痕量黏性样本,如何阴转阳?我们大胆的提议:

在样本量非常有限的情况下,我们要考虑解决的首要问题不是核酸提取试剂盒,而应该是在核酸提取之前如何处理样本,使这一点点样本中的病毒核酸得以充分释放。

也就是说在新冠肺炎病毒的整个检测环节中,做好核酸提取前的样本处理,从痕量难处理的样本中充分释放病毒核酸才是关键中的关键!改变核酸提取前的样本处理方式有可能使假阴性的概率降低

在临床样本采集量有限的情况下,我们要把目光投放在核酸纯化前的样本处理上,即通过更有效的手段,比如使用聚焦超声技术的物理裂解方法结合化学裂解法对采集的样本进行病毒灭活、匀浆或者液化处理,充分释放病毒核酸,使后续核酸纯化获得足够且高质量的病毒RNA,这是现有条件下提高检测灵敏度的根基,可以减低可疑或者假阴性结果

在呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus, RSV)的鉴定案例中,作者比较了Covaris聚焦超声技术(AFA)处理痰液结合MNAzyme探针法与Glass beads研磨方法处理痰液结合TagMan探针法对RSV病毒提取及扩增效率的影响。结果显示,与Glass beads方法相比,经Covaris AFA超声法处理后提取的核酸样本,检测到的Ct值明显减小(变化范围1.0 - 4.0 log,灵敏度提高10-10000倍),即经Covaris AFA超声法处理的样本提取的病毒RNA得率更高。尤其是在7号样品中,使用Glass beads方法处理的样本,检测RSV-B呈阴性,而Covaris方法处理的样本检测结果为阳性。(如下表)

在这个案例中,Covaris AFA超声法处理痰液的时间仅仅是30秒。这是因为聚焦超声技术的声波频率(500kHz)远远高于普通水浴超声,集中的能量可以在低温条件下几分钟内将病毒彻底灭活,同时充分释放病毒核酸以便提高病毒核酸得率。既可以保护检测人员的安全,又可以提高工作效率,降低假阴性概率。

下面这个分枝杆菌鉴定的案例,也充分证明了这一点。

分枝杆菌

分枝杆菌在自然界中普遍存在,在临床上,可引发个体全身或局部的破坏性感染。由于不同种类的分枝杆菌感染需要不同的治疗方案,因此菌株的快速准确鉴定对于疾病诊断和有效的抗生素治疗至关重要。

常规方法(高温灭活和珠子处理)完成一次菌株灭活及多肽提取需要95.5分钟,其中95℃灭活30分钟,使用聚焦超声技术完成一次菌株灭活及多肽提取仅需4.5分钟,其中18℃灭活仅需2分钟,接受测试的21个种属182份样品在2分钟处理条件下完全灭活。比传统方法节约28分钟。

处理后的样本使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行鉴定。结果显示,利用Covaris AFA技术处理的样本鉴定所得到的平均置信度得分Log值为2.07(1.90-2.26),而传统方法提取鉴定的平均得分为1.96(1.52-2.20)。并且,当使用≥2.0作为cut-off临界值时,AFA鉴定的准确率为66.7%,而传统方法则为41.7%;当分别以≥1.8和≥1.7作为cut-off临界值时,传统方法的准确率为66.7%和83.3%,而AFA方法鉴定的准确率为100%。(见下表)

(注:得分表示未知样品的质谱图谱与数据库中已知样品的图谱的相似程度,Log值越高,表明待测样品的细菌蛋白质鉴定的灵敏性和准确度越高)

同时作者还发现,使用Covaris AFA聚焦超声处理的菌株,在鉴定时的重复性也远远高于传统处理方法。具体表现为:在以≥1.7作为cut-off临界值时,AFA聚焦超声提取样品2-4个重复点鉴定的一致性为100%,而传统方法鉴定需要4个点的重复才能达到77.5%的一致性,2个点重复时仅有38.3%。(见下表)

由此可见,对于常规方法难以获得理想提取效果的临床样本,比如新冠肺炎的咽拭子或痰液样本,只需要在核酸提取之前加一步Covaris AFA超声处理,即可在极短时间内将病毒完全灭活且不影响RNA 提取质量,充分释放医学样本中的病毒核酸,提高后续病毒核酸提取得率,从源头上提高检测灵敏度,降低假阴性概率。

基于聚焦超声技术的高性能样本处理方法

Covaris 自动聚焦声学技术 (Adaptive Focused Acoustics™,AFA)作用于微量珍贵临床样本,可以有效提高核酸得率。该技术整合了非线性、高强度、会聚性声学冲击波和高级计算机控制系统。通过圆盘状传感器将声波能量聚焦在样品上,且能量强度可控,采用非接触并等温的方式进行样品的匀浆或混匀。


Adaptive Focused Acoustics™,AFA

如果您的实验室里有Covaris AFA 样本处理系统,并且您的实验室正在进行新冠肺炎病毒相关的检测工作,我们愿意为您提供我们能力范围内最大的支持,与您一起,攻克难关。

了解Covaris AFA超声处理技术在新冠病毒检测中的应用

参考文献:

1 David Nauwelaersa,∗, Leen Vijgenb et al. "Development of a real-time multiplex RSV detection assay for difficult respiratory samples, using ultrasone waves and MNAzyme technology" Journal of Clinical Virology 46 (2009) 238–243
2 La’Tonzia, L. Adams, et al. "A Rapid Standardized Protein Extraction Method Using Adaptive Focused Acoustics for Identification of Mycobacteria by MALDI-ToF MS." Diagnostic Microbiology and Infectious Disease (2016).




基因有限公司作为一家专业性的生命科学仪器、试剂供应商,自1992年成立以来一直秉承着“Let Professionals Serve Professionals”的宗旨,力求将最先进的技术方法推荐到国内,为广大客户提供包括技术咨询、产品选配、售后培训及维护的专业服务体系,并作为Covaris 在中国的合作伙伴,可为感兴趣的客户提供专业的产品咨询、技术答疑及联系试用等,欢迎大家前来咨询,我们愿与大家一起努力,攻克难题。

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