如何使用AzureRed进行western blot总蛋白归一化

简介

“总蛋白归一化”或TPN变得越来越流行，可以避免依赖看家蛋白进行归一化的许多缺点。不易受样品之间蛋白变化的影响，不是观察一种蛋白的强度，而是每条泳道的总灰度值。由于TPN技术消除了许多与信号归一化相关问题，因此发表文章越来越多地要求使用总蛋白信号进行归一化。

AzureRed荧光蛋白染色是一种用于凝胶和印迹膜定量总蛋白染色试剂，与westernblot下游蛋白分析兼容。AzureRed是全蛋白定量的理想选择，包括转印后染色以确认从凝胶到膜的蛋白转印情况，以及定量蛋白等。

AzureRed 总蛋白和三个靶标同时成像

方法

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离HeLa细胞裂解物，并将蛋白从凝胶转印至低荧光PVDF膜。蛋白转印后，用AzureRed荧光蛋白染色剂（Azure Biosystems产品AC2124）染色印迹膜。30分钟后，使用Azure Fluorescent Blot Blocking Buffer封闭膜，之后进行抗体孵育。

表1

使用Sapphire双模式多光谱激光成像系统四种激光同时扫描印迹膜成像。如表1所示，使用520nm激光检测AzureRed染色的总蛋白，使用AzureSpot软件分析图像。

结果

在Sapphire系统上同时扫描膜上AzureRed染色的总蛋白和三个靶标蛋白，得到一张四通道图片（图1）。所有四个通道都作为图像捕获的一部分进行成像和对齐，图像无需在后期进行位置对齐，也无需在工作流程中添加任何其它成像步骤。叠加图像容易将三种蛋白与总蛋白进行比较。

图2.与常见的看家蛋白相比，AzureRed具有更宽的线性动态范围
A）AureRed染色总蛋白B）Tubulin C）β-action和D）GAPDH。AzureRed信号的优异动态范围与实际加载的蛋白量显示在图像（A）中。

图3.使用AzureRed对Tubulin条带信号进行归一化
使用AzureSpot软件定量Tubulin蛋白条带。原始的Tubulin条带灰度（蓝色直方图）和总蛋白归一化的条带灰度（橙色直方图）。使用AzureRed归一化信号可校正上样误差或膜转印所产生的差异。

结论

AzureRed荧光蛋白染色是荧光Western blot全蛋白定量的理想选择。宽广的线性动态范围确保AzureRed成为解决蛋白上样变化的有效标准。AzureRed的一个关键特性是将其融入现有Western blot工作流程的简单性（图4）。

AzureRed染料可与常用荧光抗体同时检测，无干扰，允许在一张印迹膜上检测多种蛋白质。有关AzureRed荧光蛋白染色的更多信息，请访问www.azurebiosystems.com

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