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基因组编辑界的又一大进步:几乎对PAM无依赖性的Cas9变体

【字体: 时间:2020年03月30日 来源:

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  CRISPR-Cas系统被誉为新一代的遗传学工具。但是,CRISPR-Cas系统需要与靶标相邻的PAM序列以促进Cas酶识别和结合至该位点。

CRISPR靶向特异性是由两部分决定的,一部分是RNA嵌合体和靶DNA之间的碱基配对,另一部分是Cas9蛋白和一个短DNA序列,这个短的 DNA序列通常在靶DNA的3'末端发现,被称为间隔序列前体临近基序(protospacer adjacent motif,PAM),它存在于病毒DNA中,但不存在于细菌DNA中,有助于防止细菌DNA被自身的免疫系统(CRISPR)切割。

PAM序列在我们的DNA中也很常见,因此CRISPR-Cas9已被用于编辑人类基因组,但是有一定的限制性,不接近PAM的基因不能作为靶点。没有一个相邻、可识别的PAM序列,Cas酶将无法识别或成功附着并切割所需的DNA片段。

包括经典的化脓性链球菌Cas9的变体(SpCas9)在内不同的Cas酶可识别不同的PAM序列,但基因组的大部分仍然无法设靶编辑或更容易产生脱靶突变。例如,SpCas9和SaCas9(来自金黄色葡萄球菌)所识别的PAM序列多含鸟嘌呤/胞嘧啶(G/C-rich),因此利用已报导的碱基编辑系统无法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集(A/T-rich)区域进行精准碱基编辑操作。特别是最常用的SpCas9酶需要GG PAM序列进行识别,以至于其作用限制仅为基因组的9.9%,靶向区域十分局限。

为了克服这个障碍,过去麻省理工大学(MIT)的研究小组曾开发过一种名为SPAMALOT(Search for PAMs by Alignment of Targets)的分析软件(通过目标队列来搜索PAM),对细菌基因组进行生物信息学搜索,以寻找是否存在任何具有限制性较低的PAM的Cas9样酶序列。然后,从生物信息学搜索中创建出最佳匹配的合成版本,并评估它们在CRISPR系统中的效用。但如果一个感兴趣的基因组区域碰巧没有合适的PAM,工程师就得求助另一种Cas酶。

现在,哈佛医学院的生化学家Benjamin P. Kleinstiver博士领导的研究小组设计了不需要特定PAM就能结合和切割DNA的Cas9蛋白变体,命名为SpG和SpRY,能够对绝大多数人类基因组进行不受限打靶,并具有单碱基对精度,从而纠正心脏病、II型糖尿病、骨质疏松症和慢性疼痛等疾病的相关突变。

3月26日,科学家们在《Science》杂志发表了这篇具有重要意义的文章。Kleinstiver博士团队用新方法纠正了过去位于“不可编辑”基因组区域的人类疾病相关突变。

“这些工程蛋白可以更自由地靶向过去不可接近的基因组区域,”Kleinstiver说。“通过几乎完全放宽Cas酶对PAM的识别要求,基因编辑的应用被极大地拓展了。最令人兴奋的意义是,从DNA编辑角度来看,全部基因组都可‘治疗’了!”

“虽然未来需要更精确地阐明SpG和SpRY的氨基酸替换的分子作用,我们推测SpRY通过去除典型的碱基特异性相互作用,置换PAM DNA以促进相互作用来达到其扩大靶向的范围,”作者指出。“在PAM主沟中,通过添加新的非特异性蛋白质:DNA接触进行能量补偿。更实际的是,当考虑用哪种酶进行需要打靶活性的实验时,我们建议用野生型SpCas9用于承载NGG PAMs的站点,用SpG用于 NGH PAMs,用SpRY编辑剩余的NHN PAMs。”

原文检索:Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants

(生物通:伍松)

 

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