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拒绝假阴性,数字PCR技术更准确检测新冠病毒

【字体: 时间:2020年03月31日 来源:生物通

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  对于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测,实时定量PCR一直是金标准。不过对于某些患者,qPCR的结果似乎每天都在变化,而且有不少假阴性。近期的研究表明,ddPCR检测能够减少假阴性结果,而Bio-Rad Laboratories公司也利用其微滴式数字PCR系统开发出新型冠状病毒的检测产品。

对于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测,实时定量PCR(qPCR)一直是金标准。不过对于某些患者,qPCR的结果似乎每天都在变化,而且有不少假阴性。近期的研究表明,ddPCR检测能够减少假阴性结果,而Bio-Rad Laboratories公司也利用其微滴式数字PCR系统开发出新型冠状病毒的检测产品。

数字PCR(ddPCR)不像传统的RT-qPCR那样需要根据标准品进行校准。而且,PCR反应被分割成数万个小液滴,在这种情况下,PCR抑制剂对样品的影响较小,检测灵敏度提高。在病毒载量低的情况下,例如SARS-CoV-2病毒感染的早期或无症状感染,这种检测尤为重要。

Bio-Rad数字生物学中心的生命科学营销主管Carolyn Reifsnyder表示,ddPCR对包含抑制剂的复杂样品具有特殊优势。“我们的检测是终点PCR,因此不存在qPCR所具有的抑制问题,”她解释说。“数字PCR让您更有信心,不会出现假阴性。”

我国的研究人员本月在medRxiv上发表了两项小型研究,表明数字PCR具有更高的灵敏度,并且能够检测出金标准RT-qPCR所错过的感染。

第一项研究是在武汉疫情暴发期间对ddPCR检测的评估。这项研究是由中国计量科学院、武汉和北京的疾控中心以及重庆大学联合开展的。研究人员利用Bio-Rad的QX200系统,对103名疑似患者、75名密切接触者和16名康复期患者进行检测,并将结果与三种不同的RT-qPCR试剂盒进行比较。他们发现ddPCR的检测限是两个拷贝,总体准确度约为96%。

对于疑似感染SARS-CoV-2的发烧患者,使用ddPCR的检测率从28%提高到87%。对于密切接触者,阳性率从21%降低至1%。研究人员还发现,年长的康复期患者在较长时间内具有较高的病毒载量。他们认为,ddPCR的灵敏度提高,特别适合判断这些患者是否应解除隔离。

第二项研究是由武汉大学的研究人员开展的。他们采集了57名患者的咽拭子,并比较了ddPCR和RT-qPCR的结果。研究人员在两种检测方案中使用了相同的引物和探针,发现ddPCR的检测限比RT-qPCR低500倍以上,总体准确度大约为94%。而且,在14名康复期患者中,9名患者的RT-qPCR检测结果为阴性,但实际上通过ddPCR可以检测到病毒。

文章的资深作者、武汉大学病毒学国家重点实验室的陈宇教授指出,咽拭子的病毒载量较低,而且由于大量的假阴性报告不可避免,导致未能及时诊断,尽早治疗或中断传播链。

他指出,尽管小规模使用时ddPCR的成本略高于RT-PCR,但如果大规模使用,则成本几乎相同。此外,考虑到ddPCR检测的准确性更高,因此可能不需要像RT-PCR那样对患者进行重复检测,在这种情况下,ddPCR实际上比RT-PCR更便宜。

“我们建议将ddPCR作为标准RT-PCR的补充。RT-PCR阴性的结果可利用ddPCR再次检测,因为RT-PCR的阳性结果是可靠的,”陈宇指出。他认为,目前应对COVID-19危机时,所有诊断SARS-CoV-2的方法(包括RT-PCR、ddPCR、IgM/IgG抗体检测和CT扫描)都有所帮助,应根据实际情况选择使用。

Bio-Rad的检测策略

根据Reifsnyder的说法,Bio-Rad一直在开发基于探针的三重检测,也就是检测SARS-CoV-2 N基因上的两个靶点,以及Rpp30基因,后者是人RNase P基因的标志物,可作为阳性对照。该检测使用鼻咽拭子和多孔板,因此可以同时运行96名患者的样品。“不需要qPCR那样的标准曲线,因此您不会浪费任何孔,”她说。检测时间大约为五个半小时。

Bio-Rad与Biodesix合作开发了ddPCR检测,并申请美国FDA的紧急使用授权,以便用于CLIA实验室的检测服务。此外,他们自己也在开展研究,争取成为EUA的检测制造商。同时,Bio-Rad还在与全球其他监管机构积极展开对话。

这款ddPCR检测可在QX200系统以及QXDx系统上运行,QXDx系统在去年2月获得了美国FDA的许可。Reifsnyder解释说:“QX200和QXDx基本上是同一台仪器。QXDx根据美国的临床应用进行了调整,而QX200通过了CE-IVD认证。不过,随着全球监管要求的放松,在疫情期间许多实验室也能够在RUO仪器上检测SARS-CoV-2。”

除了临床检测,Bio-Rad还提供了多个产品来支持COVID-19的研究和诊断开发。例如,他们提供了一步法RT-qPCR预混液,该预混液经过优化,可直接从RNA中扩增靶点,此外还有SARS-CoV-2标准品以及阴性标准品。这些材料是由去年被Bio-Rad收购的Exact Diagnostics公司开发的。当然,还有CFX实时定量PCR检测系统,包括CFX96 Dx、CFX96 Touch和CFX384 Touch。

Reifsnyder表示:“如今,我们正在全天候工作,向包括公司和政府实验室在内的世界各地的实验室提供qPCR产品。” Bio-Rad并没有透露具体的仪器安装数量,但表示到目前为止已经放置了数千台QX200仪器,而且QXDx的数量也在激增。“我们的制造工厂仍在运转中……我们的QX200和CFX生产线仍在满负荷运转,全天候生产尽可能多的仪器。”(生物通 薄荷)

相关文献:

Highly accurate and sensitive diagnostic detection of SARS-CoV-2 by digital PCR

ddPCR: a more sensitive and accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens

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