CRISPR-HOT：一种“着色”特定基因和细胞的新工具

Hubrecht研究所Hans Clevers课题组的研究人员开发了一种新基因工具——CRISPR-HOT——来标记人类器官中的特定基因。他们用新方法研究肝细胞如何分裂，以及DNA含量过高的异常细胞是如何出现的。通过禁用癌基因TP53，他们发现异常肝细胞的无规则分裂更频繁，可能有助于癌症的发展。这项研究结果发表在《Nature Cell Biology》上。

在实验室中生长的小器官被称为类器官。它们可以来自各种器官的一小块组织。改变类器官的基因有助于研究生物过程和疾病模型。但是，到目前为止，由于缺乏简单的基因组工程方法，创建转基因人类类器官已被证明是非常困难的。

CRISPR-HOT

几年前，研究人员发现CRISPR/Cas9就像一把小分子剪刀，可以精确地切割DNA的某个特定位点。这项新技术极大地简化了基因工程。“DNA的小伤口能激活细胞中两种不同的修复机制，这两种机制都可以被用来强迫细胞在伤口的部位放置一个新DNA，”Delilah Hendriks说。其中有一种被称为非同源末端连接的方法，由于貌似经常出错，所以不常被用来插入新的DNA片段。”之前的小鼠类器官研究表明，可以通过非同源末端连接插入新DNA，所以我们开始在人体器官中测试，”Benedetta Artegiani说。随后，Artegiani和Hendriks发现，通过非同源末端连接将任何DNA片段插入人体器官中，实际上比目前使用的其他方法更有效、更稳健。他们把新方法命名为CRISPR-HOT。

着色的细胞

随后，研究人员使用CRISPR-HOT将荧光标签插入到人类类器官的DNA中，让荧光标签附着在他们想要研究的特定基因上。

首先，研究人员标记了在肠道中非常罕见的特定类型细胞：肠内分泌细胞。这些细胞负责生产激素来调节葡萄糖水平、食物摄入和胃排空。因为这些细胞非常罕见，所以过去很难研究。然而，有了CRISPR-HOT，研究人员可以轻而易举地将这些细胞“涂”成不同颜色，就很容易识别和分析它们了。其次，研究人员绘制了来自肝脏特定细胞类型的类器官——胆管细胞。使用CRISPR-HOT，他们可以看到细胞骨架中的蛋白质——角蛋白（keratins）。现在他们可以以高分辨率详细观察这些角蛋白。

蓝色的角蛋白展示肝细胞骨架

出人意料的是，研究人员以超结构的方式发现细胞分化时，角蛋白也会改变表达。研究人员预计CRISPR-HOT可能有助于研究细胞的命运和分化。

肝细胞分裂异常

在肝脏内，有许多肝细胞含有两倍以上的正常细胞DNA。目前我们还不清楚这些细胞是如何形成的，以及它们是否能够凭借这些异常数量的DNA而分裂。

老年人往往含有更多的这些异常肝细胞，但尚不清楚它们是否与癌症等疾病有关。Artegiani和Hendriks利用CRISPR-HOT标记肝细胞类器官中细胞分裂机器的特定成分，研究细胞分裂过程。

Artegiani说：“我们看到‘正常’肝细胞的分裂非常有序，总是按照一定方向分裂成两个子细胞。”Hendriks说：“我们还发现了一些形成异常肝细胞的分裂。我们第一次看到‘正常’的肝细胞是如何演变成异常的。”

研究人员还研究了肝癌中常见的TP53基因突变对肝细胞异常分裂的影响。如果没有TP53，这些异常肝细胞分裂的频率会更高。这可能是TP53促进癌症发展的途径之一。

箭头指示类器官的细胞分裂：健康的(左)类器官有组织的分裂，肿瘤基因TP53被破坏的类器官(右)混乱的细胞分裂。

除了肝脏和肠道，研究人员相信CRISPR-HOT可以应用于许多类型的人体器官，可视化任何基因或细胞类型，帮助人们揭开许多与发育和疾病相关的问题。

原文检索：Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR-Cas9 precision genome editing

（生物通：伍松）