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解放军总医院与复旦大学联手解析心脏缺血再灌注损伤的机理

【字体: 时间:2020年04月20日 来源:生物通

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  DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)是一种新型诱导剂,可促进线粒体凋亡并抑制肿瘤生长,但它在心血管疾病中的作用仍不清楚。最近,解放军总医院和复旦大学等机构的研究人员阐释了DNA-PKcs在心脏缺血再灌注损伤中的作用。

DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)是一种新型诱导剂,可促进线粒体凋亡并抑制肿瘤生长,但它在心血管疾病中的作用仍不清楚。最近,解放军总医院和复旦大学等机构的研究人员阐释了DNA-PKcs在心脏缺血再灌注损伤中的作用。

这篇题为“DNA‑PKcs promotes cardiac ischemia reperfusion injury through mitigating BI‑1‑governed mitochondrial homeostasis”的文章于2020年1月发表在《Basic Research in Cardiology》杂志(IF:6.470)上。

背景

大量证据表明,线粒体损伤后心肌细胞死亡的关键作用是提示心肌缺血再灌注(IR)损伤,但这背后的病理调控网络仍不清楚。DNA-PKcs是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族中的成员,其作用是响应各种应激条件,如衰老、辐射和氧化应激等。近期的多项研究提示,DNA-PKcs可能是线粒体损伤的罪魁祸首,并且与Bax参与的线粒体凋亡相关。

Bax介导的线粒体凋亡是从Bax转位到线粒体外膜开始的。Bax插入线粒体外膜,使其更具渗透性,从而引发凋亡的执行。Bax抑制剂(BI-1)是一种高度保守的细胞死亡抑制剂,在细胞死亡的调控中发挥重要作用。尽管BI-1与不同的生理和病理过程相关,但其在心血管系统中的作用还不大清楚。考虑到DNA-PKcs会促进Bax相关的线粒体凋亡,研究人员此次想了解DNA-PKcs在心脏缺血再灌注损伤和线粒体损伤中的潜在作用,其重点放在BI-1。

DNA-PKcs缺失可减轻IR损伤引起的心肌炎症

为了评估IR损伤时心脏DNA-PKcs的变化,研究人员检查了总体和磷酸化DNA-PKcs。与对照相比,Ser2056处的DNA-PKcs磷酸化在再灌注6小时后达到峰值,且氧化应激在DNA-PKcs活化中起作用。为了进一步了解DNA-PKcs在IR损伤中的作用,他们制备了心肌细胞特异性的DNA-PKcs敲除(DNA-PKcsCKO)小鼠,并对其进行IR处理。结果表明,IR诱导的DNA-PKcs磷酸化在DNA-PKcsCKO小鼠中不再出现,且IR损伤引起的心肌梗死和TUNEL凋亡也显著减轻。更多实验证实了IR介导的氧化状态在DNA-PKcs激活中起作用,导致氧化性心肌细胞死亡。

研究人员发现,与DNA-PKcsf/f小鼠相比,DNA-PKcsCKO小鼠的DNA-PKcs缺失大大减轻了IR处理引起的心脏功能受损。此外,IR损伤明显增加了粘附分子ICAM-1,而其作用因DNA-PKcs缺失而减轻。同时,DNA-PKcsCKO心脏中粘附分子的减少导致心肌中Gr1+中性粒细胞的募集减少,表明DNA-PKcs在心肌再灌注炎症反应中具有诱导作用。相应地,DNA-PKcs的缺失抑制了再灌注介导的促炎因子的升高。这些结果表明,DNA-PKcs的破坏保护小鼠免受IR损伤介导的心脏功能障碍(图1)。


图1. 再灌注介导的心脏功能障碍和心脏炎症反应在DNA-PKcsCKO小鼠中得到缓解。

DNA-PKcs缺失可阻止Bax相关的线粒体凋亡

线粒体凋亡是在IR损伤中导致细胞死亡的关键事件。于是,研究人员想了解IR介导的心肌线粒体凋亡是否归因于DNA-PKcs的活化。数据表明,缺氧复氧(HR)损伤促进了mPTP的开放和Caspase-9/3的激活,而这些反应被DNA-PKcs缺失所抑制。考虑到DNA-PKcs与Bax之间的正相关关系,他们接着检测了DNA-PKcs缺失是否可通过清除线粒体Bax(mito-Bax)来对抗线粒体凋亡。体外研究发现,IR损伤上调了mito-Bax的水平,而DNA-PKcs缺失下调了mito-Bax的水平。同时,DNA-PKcs的缺失也与线粒体抗凋亡分子(如Bcl2)的增加密切相关。这些数据表明,DNA-PKcs缺失可阻止IR损伤引发的Bax相关的线粒体凋亡。

BI-1在IR损伤环境中维持线粒体的功能

BI-1是一种促生存分子,可能促进了DNA-PKcs缺失对线粒体损伤的保护作用。实验表明,IR损伤导致DNA-PKcsf/f小鼠中的BI-1表达显著下降,而DNA-PKcs的缺失在再灌注的早期和晚期均阻止BI-1的下调,揭示IR损伤中BI-1与DNA-PKcs之间呈负相关(图2)。

为了进一步证实DNA-PKcs对BI-1表达的作用,他们通过Ad-DNA-PKcs转染在心肌细胞中过表达DNA-PKcs。在HR处理后,Ad-DNA-PKcs转染以剂量依赖的方式引起DNA-PKcs的磷酸化,并导致BI-1的表达水平降低。相反,DNA-PKcs的缺失逆转了IR-诱导的BI-1水平下降。这些结果再次确认了DNA-PKcs是BI-1上游的负向调节因子。后续实验表明,DNA-PKcs通过促进蛋白酶体降解,对BI-1的稳定性产生了负面影响。


图2. DNA-PKcs缺失使得心肌细胞中的BI-1稳定。

研究人员怀疑,DNA-PKcs缺失所带来的心脏保护作用是否要归因于BI-1的上调。为了检验这种假设,他们生成了心肌细胞特异性的DNA-PKcs/BI-1双缺陷小鼠。与对照相比,IR损伤在BI-1CKO小鼠中造成了更明显的心脏损伤,相比之下,DNA-PKcsCKO小鼠的梗死面积更少,TUNEL+细胞更少,心脏损伤减弱,而心脏功能改善。有意思的是,BI-1缺失抵消了DNA-PKcs缺失所带来的保护作用(图3)。同时,他们还发现,DNA-PKcs缺失以BI-1依赖的方式大大减弱了HR介导的线粒体Bax转位。


图3. BI-1缺失抵消了DNA-PKcs缺失对再灌注心脏的保护作用。

鉴于线粒体在心脏IR损伤中的主要作用,他们继续研究了DNA-PKcs/BI-1信号级联在线粒体稳态中的作用。他们利用免疫荧光法检测评估了线粒体的形态。再灌注刺激迫使线粒体分裂成碎片,并伴随着线粒体分裂相关蛋白(如p-Drp1和Mff)的表达增加。有意思的是,DNA-PKcs缺失保留了线粒体网络的结构,抑制了分裂相关因子。然而,BI-1缺乏又抵消了DNA-PKcs缺失对线粒体稳态的保护作用。

为了进一步巩固BI-1在再灌注心脏中的有益作用,研究人员又采用了BI-1TG小鼠。与对照组相比,BI-1水平因再灌注而下调,组织学损伤增加,包括梗死区扩大和心脏功能受损。不过,BI-1TG小鼠在IR损伤后表现出梗死面积明显减少和心肌功能的改善。此外,在BI-1TG小鼠中,再灌注介导的心肌细胞死亡和Bax相关的线粒体凋亡大大减弱。这些数据表明,对于心脏再灌注损伤,BI-1蛋白的重新引入对心脏有益,并维持了线粒体完整性。

结语

“我们的数据表明,DNA-PKcs为响应IR损伤而激活,通过抑制BI-1导致心肌细胞的线粒体凋亡。这些结果首次描述了DNA-PKcs/BI-1级联在线粒体失调和心肌死亡发病中的关键作用,” 作者在文中写道。他们认为,在管理心肌再灌注损伤时,DNA-PKcs-BI-1有望作为治疗靶点。(生物通 余亮)

原文检索

Zhou H, Toan S et al. DNA‑PKcs promotes cardiac ischemia reperfusion injury through mitigating BI‑1‑governed mitochondrial homeostasis. Basic Res Cardiol. 2020 Jan 9;115(2):11. doi: 10.1007/s00395-019-0773-7.

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