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定性 or 定量?选择合适的蛋白质组学研究工具

【字体: 时间:2020年04月30日 来源:生物通

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  在此,我们将介绍两种适用于蛋白质组学研究的流行工具:抗体芯片(antibody array)和质谱(MS)。这两种方法可以单独使用,它们产生的数据可以是定性的、半定量的或定量的;也可以结合使用,以提高蛋白质组的覆盖度。

近年来,高通量技术平台的开发大大推动了蛋白质组学研究工作。这些适用于蛋白质分析和标志物开发的平台让研究人员能够在单次分析中检测数千种蛋白质。不过,您可能又会面临甜蜜的负担,不知道应该选择哪个平台。

在此,我们将介绍两种适用于蛋白质组学研究的流行工具:抗体芯片(antibody array)和质谱(MS)。这两种方法可以单独使用,它们产生的数据可以是定性的、半定量的或定量的;也可结合使用,以提高蛋白质组的覆盖度。当然,具体使用哪种工具要取决于您想回答的问题。

抗体芯片

抗体芯片利用固定在固态基质(比如硝酸纤维素膜、载玻片或微珠)上的抗体来捕获样品中特定的蛋白质靶点。之后,利用标记的检测抗体来确认前面两者的结合,反应所产生的信号与捕获的分析物的量成正比。

蛋白质的鉴定过程也很简单。对于抗体芯片,利用spot的位置可判断蛋白质。至于CBA(流式细胞微球芯片),根据微珠的颜色可以鉴定蛋白质。这些技术的主要优势在于凭借出色的抗体灵敏度,它们能够检测低丰度的蛋白质。不过,前提是市场上有经过验证的抗体,并且与抗体芯片平台兼容。

第一张商品化的抗体芯片Ab Microarray 380是由美国BD Clontech公司推出的。目前,RayBiotech、R&D Systems(Bio-Techne)、CST、BD、Abcam等多家公司提供抗体芯片。若想筛选尽可能多的蛋白质,不妨选择抗体数量多的芯片,比如RayBiotech的Human L2000 Array包含多达2,000个抗体;若想聚集某一条特定通路,则可以选择相应的产品。

质谱分析

液相色谱串联质谱(LC-MS)是蛋白质组学研究中最常用到的形式。它首先将蛋白质变性、还原、烷基化和消化,然后对产生的肽段进行分离和离子化。之后根据其质量和片段将每个带电荷的肽段分配给蛋白质。一次质谱分析可鉴定出5,000多种蛋白质,具体取决于上游样本制备和基质。

质谱分析的局限性在于,高丰度的蛋白质可能通过离子抑制而掩盖低丰度蛋白的检测。因此,人们有必要事先去除高丰度蛋白,或富集低丰度蛋白。不过,质谱分析是“无假设的”,因为它不依赖于抗体进行检测,也就无需假设哪些蛋白质是关注的重点。

双管齐下

尽管抗体芯片和质谱在灵敏度、通量和广度方面都有所不同,但同时使用这两种技术,有望帮助研究人员提高蛋白质组覆盖度。例如,抗体芯片可实现低丰度分析物(比如细胞因子及其他分泌的效应物)的重复检测,为定制治疗方案提供全局视角。相比之下,质谱可能会发现真正新颖的生物标志物,如未知的蛋白异构体或翻译后修饰,而相应的抗体还无法获得。

定性还是定量?

蛋白质组学研究所产生的数据可以是定性的、半定量或定量的。侧向流层析检测(如验孕棒)的结果是定性的,可通过肉眼观察快速得出是与否的答案。半定量的读数则包括吸光度、像素和荧光,所有这些都可以表示为信号变化的比值。与定量方法相比,半定量方法的优点在于成本通常较低。

抗体芯片和质谱都可以提供半定量或定量的数据,但相对而言,从商业化芯片上获得定量数据显然要轻松得多。芯片制造商会针对检测板中的每个目标优化标准曲线,而定量质谱分析则需要用户针对每个同位素标记的肽段校准仪器。因此,用定量的抗体芯片来验证半定量的质谱数据,也不失为一种好方法。

选择哪种方法?

首先,您需要明确研究目的,才能确定是单独使用抗体芯片或质谱,还是联合使用。当研究主题围绕着特定的疾病或生物学过程时,抗体芯片是最合适的平台,因为它们由一组预先选择的抗体组成,这些抗体针对的是疾病或正常状态下功能已知或存疑的标志物。如果生物标志物在很大程度上是未知的,那么质谱提供了一种无偏倚的方法来发现新的目标。

当然,若同时使用抗体芯片和质谱分析,则蛋白质组覆盖度比单独使用任一方法都要强大。这对于蛋白质图谱分析或生物标志物的发现工作特别有用。另外,您也可以用抗体芯片来正交验证质谱数据。(生物通 薄荷)

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