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又一新方法:揭示RNA如何调节基因活性

【字体: 时间:2020年05月21日 来源:生物通

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  非编码RNA在调控基因表达和染色质重塑中具有重要作用,甚至连编码蛋白质的转录本被剪切掉的内含子序列也可能具有某种调控作用——要研究这里隐藏的大量未知信息,首先得比较全面地绘制出这些RNA与哪部分染色质的相互作用。这种新技术值得一看。

哺乳动物基因组编码大量的长非编码RNA——lncRNA,大多数非编码转录本定位于细胞核,并且已证明其中一些在调节基因表达和染色质重塑中发挥作用。但多数非编码RNA的功能和作用区域仍有待研究。为了研究这类RNA的功能,研究人员已经开发出多种定位转录本与基因组相互作用位点的方法。

来自俄罗斯科学院生物技术研究中心和莫斯科物理技术学院的生物信息学家,新近开发出一种称为RADICL-seq的方法,可绘制完整细胞核中全基因组范围的RNA-染色质相互作用图谱。这种方法基于临近位置的交联连接,与现有方法相比可以减少对新生转录本的偏向性、同时提高基因组覆盖率和独特的绘图效率,可识别不同类别的转录本“占据”基因组的特有模式,以及识别细胞类型特异的RNA-染色质相互作用,并揭示转录在染色质结构形成中的作用。

RNA和基因调控

尽管同一机体所有细胞都共享相同的基因组DNA,但每种类型的细胞中活性表达的基因集合各有不同——从而产生不同水平的蛋白质组合,表现出不同的细胞特征和功能——比如脑细胞不同于血细胞,尽管它们共享相同的DNA。如今科学家普遍认为,RNA是决定哪些基因表达或活跃的因素之一。

大多数长非编码RNA与染色质相互作用。染色质具有改变其构象或“形状”的能力,从而可以“隐蔽”或者“暴露”出某些基因以便进行转录。长非编码RNA可通过与某些染色质区域相互作用,促成这种构象变化,由此影响基因活性变化。要了解非编码RNA对基因组调节和结构维持具有哪些调节潜力,首先是要知道某个的RNA与哪个染色质区域相互作用。

现在有多种技术能够定位lncRNAs与基因组相互作用,但是有的需要使用反义RNA探针而通常不适用于denovo从头发现的lncRNA,或者不适合在多种细胞类型中的高通量应用;还有的技术能够评估全基因组RNA与染色质相互作用但是需要大量input细胞。有的需要使用Dpn II消化染色质、由于Dpn II在整个基因组中的位点数量有限而使得其对捕获的RNA与DNA相互作用的覆盖范围有限。

发表在《自然通讯》上的这项技术称为RADICL-seq(RNA And DNA-Interacting Complexes Ligated and sequenced ),将RNA和DNA相互作用复合物进行连接并测序——它可以在RNA与基因组靶标区域相互作用时捕获RNA,并对捕获的每个RNA进行全面定位。

RADICL-seq方法的主要步骤如下:借助1%甲醛处理细胞使之交联固定,然后分离细胞核,通过用DNAseI酶部分消化基因组DNA;再用RNase H处理来消化核糖体RNA以提高结果的准确性;用桥接适配子(bridge adapter)将相邻的DNA和RNA连接起来,去交联化后,将RNA-DNA嵌合体转化为双链DNA,再进行测序。

解码非编码RNA

与其他现有方法相比,RADICL-seq的优点在于
1.具有更高的分辨率——用DNase I对染色质进行非序列依赖性消化代替限制酶,使得切割位点更为均匀而克服此类分辨率限制;
2.更高的准确性——顺磁性羧化微珠方便彻底清洗多余的DNA碎片和适配子以降低噪音并可有效减少对起始输入材料量的需求,RNase H消化RNA-DNA杂交产物可减少RADICL-seq捕获的新生RNA-染色质相互作用的比例,从而提高其他类型相互作用的捕获率。
3.使用Eco P15I产生大小一致的RNA和DNA读取片段大大改善了与基因组的比对。
RADICL-seq实现了更高的检测能力,因此具有更好的性/价比。

卓越分辨率使研究人员不仅可以检测染色质与非编码RNA的相互作用,还可以检测出染色质与编码蛋白质基因的内含子RNA序列的相互作用。研究表明,多数长非编码RNA顺式结合临近的基因组靶标(短距或中等距离)。令人惊奇的是,编码蛋白质的基因转录本中被剪切掉的内含子在这种RNA与染色质的顺式相互作用中占相当部分。这种结合看来是稳定的,研究人员观察到有内含子RNA介导的相互作用可抑制转录延伸达数小时之久。因为已有被剪切下来的内含子对酵母生长表型具有生物学作用的报道,作者认为在高等真核生物钟也可能存在类似的机制——特定的内含子RNA躲过降解并与染色质顺式相互作用,调控临近基因的转录。

该技术还可以用于研究细胞类型特异性的RNA染色质相互作用。研究人员在小鼠实验中发现,染色质与两种不同细胞(即胚胎干细胞和少突胶质祖细胞)中的RNA之间的相互作用模式与这些细胞类型中的优势基因表达相关。

新方法所具有的灵活性意味着科学家可以通过修改实验来收集更多的生物学信息。特别是该技术可以鉴定出不是由染色质蛋白介导的直接RNA-DNA相互作用。来自生物技术研究中心和MIPT的生物信息学家进行的分析表明,不仅DNA和RNA之间的标准双螺旋相互作用,而且涉及RNA-DNA三链体的相互作用都可以参与基因调控。同样,这种相互作用突出了非编码RNA在靶向特定基因位点的蛋白质中的重要性。

“我们计划进一步研究RNA在调节基因表达,染色质重塑以及最终在细胞身份方面的作用。希望我们能够在不久的将来通过使用这些非编码RNA来调节基因。这对治疗疾病特别有帮助。” Yulia Medvedeva说是RAS生物技术研究中心的调控转录组学和表观基因组学组负责人,并领导了MIPT细胞技术生物信息学实验室。她还管理着由俄罗斯科学基金会(该研究共同资助)资助的资助项目。

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