生物通 | 新技术专栏

从ChIP-seq到CUT&RUN,蛋白质-DNA互作技术揭秘

【字体: 时间:2020年05月22日 来源:生物通

编辑推荐:

  尽管ChIP-seq在近年来已广泛使用,但并不完美,还存在这样那样的问题。下面,我们就来看看ChIP-seq技术是如何一步步演化的。

染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)结合两种强大的技术,来研究蛋白质与DNA之间的相互作用。它具有灵敏度高和覆盖度高等特点,主要应用于转录因子结合位点、组蛋白修饰、基因组甲基化以及核小体定位等研究。

顾名思义,整个操作分为两部分。首先是通过染色质免疫沉淀技术(ChIP)特异性地富集与目标蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集到的DNA片段进行高通量测序(seq)。尽管ChIP-seq在近年来已广泛使用,但并不完美,还存在这样那样的问题。下面,我们就来看看ChIP-seq技术是如何一步步演化的。

传统ChIP-seq

我们先来了解一下传统ChIP-seq的工作原理。首先,利用甲醛固定细胞(甲醛让DNA与蛋白质交联),再通过超声或酶解消化将染色质片段化。接着,让特异性的抗体与您感兴趣的DNA结合蛋白相结合,通常是转录因子。与抗体结合的染色质片段被免疫沉淀,然后将DNA片段纯化并构建成文库,用于后续的高通量测序。

利用ChIP-seq,研究人员能够研究健康和疾病状态下的基因表达谱,从而有可能发现生物标志物。这是一种无偏向的检测技术,能够完整显示ChIP富集DNA包含的信息。与ChIP-chip相比,ChIP-seq的优势在于强大的开放性,寻找未知信息的能力。当然,这种技术也存在一些缺陷。

甲醛固定就是饱受诟病的地方。甲醛处理可能会导致蛋白质的交联或抗原表位的掩盖。在蛋白质交联后,您可能会捕获到不相关的染色质片段,产生误导性的数据。而表位掩盖会阻止免疫沉淀过程中抗原与抗体的结合。于是,天然ChIP-seq(Native ChIP-seq)应运而生。

天然ChIP-seq

天然ChIP-seq抛弃了甲醛固定的方法,而是利用微球菌核酸酶(MNase)的切割特性来进行染色质消化。微球菌核酸酶可以快速温和地将染色质DNA切断,并最大限度地保留细胞原有的染色质结构以及目标蛋白与DNA的结合状态,从而大大提高ChIP的结果可信度。

不过,缺乏了交联的步骤,意味着只有与染色质紧密结合的蛋白质能被免疫沉淀,如组蛋白。在染色质消化和免疫沉淀期间,蛋白结合丢失可能会使数据出现偏差。因此,天然ChIP-seq可能会面临重要信息的丢失。同时,它的另一个局限是从整个基因组中采样。超声处理或酶解消化导致细胞核被破坏,整个基因组溶解,这意味着需要深度测序才能区分目标和背景。

ChEC & ChIC

之后,人们又开发出染色质内源切割(ChEC)和染色质免疫切割(ChIC)这两种技术,不再需要用到超声处理或酶解消化。两种方法都将无活性的微球菌核酸酶(MNase)系在感兴趣的染色质蛋白上,一旦激活,MNase裂解DNA,然后将其提取并测序。

尽管这些技术代表了ChIP-seq的重要进步,但ChEC的缺点在于在体内表达染色质-MN融合蛋白,这意味着必须根据每种待研究的染色质蛋白构建不同的重组体。ChIC则利用抗体将感兴趣的蛋白与Protein A-MN相结合来进行DNA切割,从而避免了构建重组体,但有些ChIC方案引入了甲醛固定操作,又重新回到了最初的问题。

近期大热的CUT&RUN

这两年最火红的技术应该是CUT&RUN,全称为cleavage under targets and release using nuclease,由美国Fred Hutchinson癌症研究中心的Steven Henikoff团队开发。从2017年问世至今,目前已有多篇高影响因子的文章发表。

这项技术的主要特点是,它可以在完整的细胞或细胞核上进行,无需甲醛固定或超声处理。抗体与目标蛋白结合,而其Fc段连着Protein A-MNase或Protein A/G-MNase。MNase酶切割染色质复合物,这些经过切割的片段扩散到细胞核外,而未切割的部分留在核内。之后从上清液中收集DNA片段并测序。


CUT&RUN技术的示意图(图片来自Henikoff实验室)

详细的操作方案已发表在《Nature Protocols》杂志上1。与传统的ChIP-seq相比,它避免了交联的问题;而与天然的ChIP-seq相比,它又大大降低了背景。CUT&RUN的另一个好处是,下游测序中仅仅包含相关的染色质复合物,因此它能够降低测序读数,从而加快实验进程。

与传统的ChIP-seq相比,CUT&RUN技术所需的样本更少,适合研究稀有的细胞群体。仅需100个细胞,它就能分析特定的组蛋白修饰。去年,匹兹堡大学和马萨诸塞大学医学院的研究人员对CUT&RUN进行改进,将样本量降至单细胞水平,并应用于胚胎植入前的胚胎2。(生物通 薄荷)

参考文献

1. Skene, P., Henikoff, J. & Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat Protoc 13, 1006–1019 (2018). https://doi.org/10.1038/nprot.2018.015

2. Hainer, S., Bošković, A. et al. Profiling of Pluripotency Factors in Single Cells and Early Embryos. Cell. 2019 May 16;177(5): 1319-1329.e11. doi: 10.1016/j.cell.2019.03.014.

我来说两句
0  条评论    0 人次参与
登录 注册发布
最新评论刷新
查看更多评论 > >

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

生物通首页 | 今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器龙虎榜

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号