从ChIP-seq到CUT&RUN和CUT&Taq，蛋白质-DNA互作技术揭秘

染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）结合两种强大的技术，来研究蛋白质与DNA之间的相互作用。它具有灵敏度高和覆盖度高等特点，主要应用于转录因子结合位点、组蛋白修饰、基因组甲基化以及核小体定位等研究。

顾名思义，整个操作分为两部分。首先是通过染色质免疫沉淀技术（ChIP）特异性地富集与目标蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集到的DNA片段进行高通量测序（seq）。尽管ChIP-seq在近年来已广泛使用，但并不完美，还存在这样那样的问题。下面，我们就来看看ChIP-seq技术是如何一步步演化的。

传统ChIP-seq

我们先来了解一下传统ChIP-seq的工作原理。首先，利用甲醛固定细胞（甲醛让DNA与蛋白质交联），再通过超声或酶解消化将染色质片段化。接着，让特异性的抗体与您感兴趣的DNA结合蛋白相结合，通常是转录因子。与抗体结合的染色质片段被免疫沉淀，然后将DNA片段纯化并构建成文库，用于后续的高通量测序。

利用ChIP-seq，研究人员能够研究健康和疾病状态下的基因表达谱，从而有可能发现生物标志物。这是一种无偏向的检测技术，能够完整显示ChIP富集DNA包含的信息。与ChIP-chip相比，ChIP-seq的优势在于强大的开放性，寻找未知信息的能力。当然，这种技术也存在一些缺陷。

甲醛固定就是饱受诟病的地方。甲醛处理可能会导致蛋白质的交联或抗原表位的掩盖。在蛋白质交联后，您可能会捕获到不相关的染色质片段，产生误导性的数据。而表位掩盖会阻止免疫沉淀过程中抗原与抗体的结合。于是，天然ChIP-seq（Native ChIP-seq）应运而生。

天然ChIP-seq

天然ChIP-seq抛弃了甲醛固定的方法，而是利用微球菌核酸酶（MNase）的切割特性来进行染色质消化。微球菌核酸酶可以快速温和地将染色质DNA切断，并最大限度地保留细胞原有的染色质结构以及目标蛋白与DNA的结合状态，从而大大提高ChIP的结果可信度。

不过，缺乏了交联的步骤，意味着只有与染色质紧密结合的蛋白质能被免疫沉淀，如组蛋白。在染色质消化和免疫沉淀期间，蛋白结合丢失可能会使数据出现偏差。因此，天然ChIP-seq可能会面临重要信息的丢失。同时，它的另一个局限是从整个基因组中采样。超声处理或酶解消化导致细胞核被破坏，整个基因组溶解，这意味着需要深度测序才能区分目标和背景。

ChEC & ChIC

之后，人们又开发出染色质内源切割（ChEC）和染色质免疫切割（ChIC）这两种技术，不再需要用到超声处理或酶解消化。两种方法都将无活性的微球菌核酸酶（MNase）系在感兴趣的染色质蛋白上，一旦激活，MNase裂解DNA，然后将其提取并测序。

尽管这些技术代表了ChIP-seq的重要进步，但ChEC的缺点在于在体内表达染色质-MN融合蛋白，这意味着必须根据每种待研究的染色质蛋白构建不同的重组体。ChIC则利用抗体将感兴趣的蛋白与Protein A-MN相结合来进行DNA切割，从而避免了构建重组体，但有些ChIC方案引入了甲醛固定操作，又重新回到了最初的问题。

近期大热的CUT&RUN

这两年最火红的技术应该是CUT&RUN，全称为cleavage under targets and release using nuclease，由美国Fred Hutchinson癌症研究中心的Steven Henikoff团队开发。从2017年问世至今，目前已有多篇高影响因子的文章发表。

这项技术的主要特点是，它可以在完整的细胞或细胞核上进行，无需甲醛固定或超声处理。细胞经过透化处理（扩孔）后与目标抗体孵育，抗体进入核内与目标蛋白结合；细胞再与蛋白A/G连接的MNase孵育，目标抗体Fc段结合Protein A-MNase或Protein A/G-MNase。然后激活MNase酶切割结合位点两边的染色质，这些经过切割的片段扩散到细胞核外，而未切割的部分留在核内，可大大降低背景。之后从上清液中收集DNA片段并测序。

CUT&RUN技术的示意图（图片来自Henikoff实验室）

详细的操作方案已发表在《Nature Protocols》杂志上¹。与传统的ChIP-seq相比，它避免了交联的问题；而与天然的ChIP-seq相比，它又大大降低了背景。CUT&RUN的另一个好处是，下游测序中仅仅包含相关的染色质复合物，因此它能够降低测序读数，从而加快实验进程。

与传统的ChIP-seq相比，CUT&RUN技术所需的样本更少，适合研究稀有的细胞群体。仅需100个细胞，它就能分析特定的组蛋白修饰。去年，匹兹堡大学和马萨诸塞大学医学院的研究人员对CUT&RUN进行改进，将样本量降至单细胞水平，并应用于胚胎植入前的胚胎²。



更新的CUT&Tag

Henikoff实验室去年在Nature Communications还推出了更新的CUT&Taq技术。前面所述CUT&RUN实验获得的DNA片段纯化后需要建库测序，CUT&Taq跟CUT&RUN相比，就是用Tn5代替MNase,切割染色质同时加上建库引物接头——具体来说就是用ProteinA/G-Tn5转座复合物孵育抗体处理过的细胞，Tn5在激活后剪切结合位点两边序列同时能加上测序接头，剪切产物扩散出细胞核外后回收纯化测序。切割同时加接头这一步可以简化后继的建库步骤，以更快速度获得更高信噪比。

这两种新技术都是利用ProteinA/G与抗体的特异亲和性，借助特异性抗体将核酸酶固定靶序列附近，限制其切割范围，从而取代了过去的交联反应；此外回收扩散出细胞外的切割产物，可大大减少无关的核酸背景，提高信噪比同时更减少测序深度的要求。   （生物通 薄荷）

参考文献

1. Skene, P., Henikoff, J. & Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat Protoc 13, 1006–1019 (2018). https://doi.org/10.1038/nprot.2018.015

2. Hainer, S., Bošković, A. et al. Profiling of Pluripotency Factors in Single Cells and Early Embryos. Cell. 2019 May 16;177(5): 1319-1329.e11. doi: 10.1016/j.cell.2019.03.014.