Moxi GO™ II新一代个人型双荧光流式细胞分析仪助力细胞凋亡研究

Moxi GO™ II完美结合了库尔特电阻抗检测技术与双通道荧光检测技术，采用了卡槽式的微流样本芯片设计，可简便用于细胞凋亡检测数据的获取。

细胞凋亡（cellular apoptosis）是一种复杂的机制，细胞利用它来小心地控制细胞损伤引起的死亡。俗称“程序性细胞死亡”，细胞凋亡通过一个系统的信号级联进行，在细胞中产生特征性的、定向的形态学和生物化学的变化。从整体效果来看，高度调控的细胞死亡过程可以*大限度地减少对细胞外环境的损伤。细胞凋亡在听力损失、心血管衰竭 、癌症进展 、神经退行性疾病和许多其他病理学中扮演着重要的角色。因此，科学研究集中于揭示细胞凋亡的潜在途径，确定其外部触发因素，鉴定治疗干预措施，并进一步探讨细胞凋亡在许多病理学中的作用。所以，细胞凋亡的检测也被确立为一个关键的指标，用于确定药剂的“生物相容性”和细胞系统中其他环境条件的影响。

目前，已经建立了许多检测方法来量化相关分子靶点的表达，如磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）在质膜中的外化和caspase酶的激活，也有其他的凋亡特征包括线粒体潜在变化，染色质凝聚和DNA断裂。然而，这些分析通常需要专业的技师、昂贵的仪器和耗时的分析，如使用western blot、ELISA和流式细胞术等技术的耗时分析。在这里，我们用Orflo公司的Moxi GO II系统和Annexin V细胞凋亡试剂盒作为一种简单、快速、有效的流式细胞术方法来研究细胞凋亡。

Annexin-V是磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。在正常的活细胞中，PS 位于细胞膜的内侧。在凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。用FITC标记的 Annexin-V 作为探针可检测细胞凋亡的发生。PI染料能够透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的细胞膜，使细胞核红染。因此，将 Annexin-V-FITC 与 PI 配合使用，可以将凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、健康细胞区分开来。预置的细胞凋亡APP可直接给出细胞分析的结果。

诱导Jurkat细胞凋亡的检测

首先，用30μM终浓度的喜树碱（camptothecin），一种已知的干扰DNA复制并导致细胞凋亡的细胞毒素，处理培养的Jurkat E6-1细胞（购于ATCC），孵育6.5小时（T=6.5）。未处理的细胞作为阴性对照（T=0）。然后制备单细胞悬浮液，用PBS洗2次，重悬后分别取100µl 1 x 10⁶个cells/ml的细胞悬液于2个EP管中，分别加入Annexin-V-FITC 和 PI染料进行处理，在室温下（25℃）分别避光孵育15分钟和5分钟，经处理后，分别加入适量的Moxi Cyte Flow试剂，涡流混匀。*后，在Moxi GO II系统中的“细胞凋亡（Annexin V）”APP和“活力（PI）”APP程序中进行检测。检测结果如下图所示：

 
a)图为喜树碱处理过的Jurkat细胞（30µM，6.5小时）的典型Moxi GO凋亡（FITC–Annexin V）散点图（荧光与细胞大小）。 48.1％（黄色框）为Annexin V +（凋亡）的百分比，51.9%为Annexin V-（健康）的百分比；
b）图为同一时间点对同一Jurkat细胞悬液的活力（PI）进行的检测结果，可以鉴定晚期凋亡/坏死细胞（100％-93％= 7％），以便轻松计算早期阶段的凋亡细胞（48.1％-7％= 41.1％）；

 
c）图为该系统将T=0和T=6.5的检测结果生成数据进行比较/叠加。显示T=0小时（灰色散点图）和T=6.5小时（彩色散点图）Jurkat细胞的Annexin V荧光与细胞大小散点图的叠加图；
d）图为T=0小时（灰色曲线）和T=6.5小时（红色曲线）样品的FITC荧光直方图。

以上的数据直观地显示了喜树碱处理的Jurkat细胞中Annexin V+细胞百分比的明显增加以及相应的细胞大小平均尺寸的减少，它是凋亡细胞的一个明显特征。Moxi GO II系统中具有独特的细胞大小变化测量功能，通过精确的Coulter原理来确定细胞的大小，这在其他流式细胞仪上是无法实现的。

诱导Jurkat细胞凋亡的动力学过程检测

由于Moxi GO II使用方便、检测和操作时间快，特别适合于动力学数据的采集。下图为Moxi GO II通过测量Annexin-V-FITC 和 PI的荧光强度来测量喜树碱诱导凋亡的动力学过程。绿色的方形点表示30μM终浓度的喜树碱处理后的Jurkat细胞检测结果；蓝色圆形点表示阴性对照（用等量二甲基亚砜（DMSO）处理）的检测结果。绿色的点表示早期凋亡百分比（Annexin V+% - PI+%）的值与药物暴露时间（Annexin V+ / PI-%）的函数，8个离散时间点的数据可以进行曲线拟合（S形，绿色虚线），从而绘制出细胞凋亡激活动力学曲线来反应细胞对喜树碱剂量的效应（基数=5.9%，*大值=34.2%，效率=35.7%/小时，50%药效时间=4hr）。另外，基于PI细胞活力测量（插图）来量化晚期凋亡/坏死细胞百分比，并在Annexin V测量过程中确认两组样本的存活率。Moxi GO II的便利性使这种基于时间的分析变得更加容易，为没有连续动力学检测仪器的实验室提供一种低成本、快速、便利的动力学检测方法。

Moxi GO™ II是美国ORFLO公司*新推出的一款小巧轻便且功能强大的双荧光通道流式细胞分析仪，体积小巧，功能强大，一次检测可以获得基于库尔特原理的金标准计数和基于荧光原理的双荧光通道检测数据，操作简单，随时随地进行检测。除了细胞凋亡的检测，还可以用于细胞活性、细胞转染效率、免疫细胞表面marker、细胞内活性氧、线粒体膜电位等的检测。如需了解和获得更多产品及应用信息，请咨询您身边的基因有限公司员工或登录基因有限公司官方网站，寻找您的专属实验方案，http://www.genecompany.com/。

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