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探索肿瘤微环境,这些新技术可以派上用场

【字体: 时间:2020年06月01日 来源:生物通

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  如今,人们的问题可能不限于“肿瘤内有多少个克隆,它们如何进化而来?”以及“驱动癌症进展的突变是什么?”,他们还想知道“免疫细胞有哪些,在哪里?它们可能扮演了什么角色?”

俗话说,“近朱者赤,近墨者黑”,这表明人的成长很容易受到环境的影响。癌细胞也一样,特别是那些组成实体瘤的癌细胞,它们的行为在很大程度上取决于周围环境。

肿瘤微环境(TME)是目前许多实验室的研究重点,他们主要是想了解恶性细胞如何与周围的邻居发生相互作用。癌症如何受到其环境的影响?反过来,癌症又如何影响肿瘤微环境?是否存在一些生物标志物,可作为潜在的治疗靶点?

在癌症研究中,一项主要的工作是了解哪些类型的细胞组成了肿瘤。病理学家通常用组织学技术(主要是染料和抗体)对肿瘤组织切片进行染色,并依靠其丰富的经验来判断。分子生物学家则利用RNA测序等技术来判断有哪些基因表达。

研究人员当然并不满足于现状,他们一直在渴望“更好、更快、更强”,因此该研究领域也在开发各种新技术,帮助人们更加细致地观察肿瘤,同时提供更多的背景信息。

如今,人们的问题可能不限于“肿瘤内有多少个克隆,它们如何进化而来?”以及“驱动癌症进展的突变是什么?”,他们还想知道“免疫细胞有哪些,在哪里?它们可能扮演了什么角色?”

转录本的测序和定位

以往,人们会从肿瘤上采集感兴趣的区域,并对其中的cDNA进行测序,以确定免疫细胞(比如调节性T淋巴细胞)以及血管和基质细胞的存在和身份。然而,这种大量细胞测序(bulk RNA-seq)的方法未必能满足需求。

10X Genomics的肿瘤学部门营销经理Abbey Cutchin认为,它仅仅提供了一个平均值,你必须利用该平均值来尝试推断哪些来自不同类型的细胞。它通常在动态范围上受到限制,因此无法解析稀有的细胞群体。

Cutchin形象地将大量细胞的RNA测序比喻为奶昔,而10x Genomics的单细胞测序(scRNA-seq)则更像是水果沙拉,每块水果都清晰可见。RNA表达数据可映射回其原本在组织上的位置,分辨率约为1-10个细胞。

Cartana的首席技术官Malte Kühnemund也认为,scRNA-seq“绝对是一种革命性的技术”,能够帮助您分解复杂的肿瘤,并研究其细胞组成。它带来了一幅全转录组的无偏视图。不过,他也表示scRNA-seq很昂贵,而且通量不太高。

其他方法则更具靶向性。例如,Bio-Techne的RNAscope®原位杂交(ISH)分析使用独家的扩增技术,一次可检测组织样本上多达12个不同的转录本。据介绍,特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端,配以自身级联放大检测原理,可灵敏检测完整细胞中的目标RNA。

当然,还有其他一些非常灵敏的多重单分子FISH技术,比如MERFISH和seqFISH。“不过,它们很难在您自己的实验室中实现,因为它们需要极其复杂的成像设备,而通量又很低,因为它们需要非常高的放大倍数,”Kühnemund解释说。

Cartana的平台利用原位测序(ISS)技术来定位组织中的基因表达,适用于FFPE和冷冻组织样本,具有更高的通量和多重检测能力,但未必有其他空间转录组学平台的灵敏度。

Kühnemund表示:“我们使用带有条形码的锁式探针,让您可以同时检测成百上千个基因。”一旦与目标RNA杂交,锁式探针就锁上,并通过滚环扩增对其进行原位扩增。之后,在组织切片上采用新一代测序技术和荧光成像,测序并解码锁式探针的条形码,并鉴定目标RNA。与其他杂交技术不同,这种原位测序技术具有单核苷酸分辨率。

研究对象是蛋白质呢?

研究人员也可以通过多种技术来观察肿瘤微环境中表达的蛋白质。例如,流式细胞术和CyTOF质谱流式细胞技术可以在单细胞水平上进行高度多重的检测,但是无法获知组织学背景信息。

据Fluidigm公司的产品总监Minalini Lakshman博士介绍,成像型质谱流式技术(IMC)将CyTOF技术与高分辨率成像相结合,可对组织和肿瘤进行深度拷问,实现单细胞和空间分析。利用这种方法不仅可以获得大量蛋白的定性、定量表达数据,更重要的是可以实现蛋白表达的“in situ”原位检测,确保了数据的完整性和准确性。

传统的免疫组化分析也能获得肿瘤微环境中蛋白质定位的信息,但NeoGenomics Laboratories的医学总监Josette William Ragheb表示,如果要染色60个生物标志物,你需要有60张玻片。由于这些是分开的,“您就无法了解不同标志物在单个细胞中的共表达”。

NeoGenomics的MultiOmyx™超多重免疫荧光检测利用重复的染色、成像和灭活过程,可以在每块4 μm FFPE玻片上检测多达60个标志物的表达。William Ragheb指出:“如果有人想研究更多,我们可以将玻片放回原处,刮擦后提取DNA或RNA,然后再检测其他分子。”

对肿瘤微环境的解析有望帮助人们更好地了解致命的恶性肿瘤,并最终对其进行治疗。研究人员如今越来越多地将肿瘤的空间结构与分子检测相结合,从而创建出更详细的图谱。这些图谱将进一步指导人们的科研和转化工作。

(作者:Josh P. Roberts / 生物通编译)

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