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干货 | ChIP实验样本处理优化指南

【字体: 时间:2020年06月23日 来源:基因有限公司

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  ChIP实验繁琐复杂,任何一个环节的失误都会导致整个实验的失败。ChIP实验的各种优化方案也是层出不穷。今天为大家总结一些独家ChIP实验优化秘籍,帮助各位挣扎在ChIP上的实验汪们早日脱离苦海。

ChIP即染色质免疫共沉淀技术,是研究蛋白质-DNA相互作用的常用实验技术,在表观遗传学和转录因子调控研究中被广泛应用。ChIP实验繁琐复杂,任何一个环节的失误都会导致整个实验的失败。ChIP实验的各种优化方案也是层出不穷。今天为大家总结一些独家ChIP实验优化秘籍,帮助各位挣扎在ChIP上的实验汪们早日脱离苦海。

我们先来看下ChIP实验流程:

ChIP实验是一个研究蛋白质和DNA相互作用的实验,因此,在这个实验中有三件事情,是最重要的:

1)要维持蛋白质和DNA手拉手的状态(固定交联要恰当)
2)抗体要能够成功识别蛋白质(抗原表位要保护好)
3)DNA的检测--下游PCR和测序要能成功(染色质片段化要均一彻底)

ChIP实验的条件是一定要进行优化的,下面我们来看看哪些部分需要着重优化和注意的呢?

一. 固定试剂以及固定时间

1) 固定试剂的选择别忽略

固定用的甲醛试剂常常被忽略。很多实验室常用的37%甲醛其实并不适合用于ChIP实验固定细胞和组织。

首先37%甲醛溶液含有甲醇:甲醇起到稳定剂的作用,可以防止氧化和甲醛缩聚,但是甲醇存在的情况下,更容易有较大分子量的染色质产生,而这些染色质不容易被打断。

其次37%甲醛是多聚甲醛,多聚甲醛会形成不同的多聚体,每种多聚体的固定效率不同,造成每次的细胞固定差异导致重复性的降低。用粉末状的多聚甲醛配制固定液也同样不推荐。

推荐大家使用16%单体甲醛溶液(ChIP级别),仅含有甲醛单体,无复合物,可以提供最好的、最准确的固定结果。最推荐的是即开即用的小支包装,如CST的12606S。

2) 建议进行甲醛固定时间的优化

绝大部分实验汪们固定的时间太久了,固定不仅与细胞系相关,甚至于蛋白抗原表位也相关。 固定时间过长不仅会使蛋白质-DNA聚合物过于紧密,导致片段化困难、解交联困难,还会导致蛋白空间结构变化,损伤抗原表位,使得抗体难以成功识别结合。当然固定时间也不要过短。

不是所有的细胞都以同样的速率得到固定,因此针对不同的细胞和组织,对固定和打断时间进行梯度实验就非常重要,建议在优化实验时,用western blot 检查蛋白表位的完整性。

另外传统的水浴和探针超声法使用超高超声能量打断染色质,因此为了减少该过程对染色质的损伤,这些方案一般会要求延长甲醛固定时间(≥10min)。

相对来说Covaris的高频短波长聚焦超声((Adaptive Focused Acoustics ,AFA),是轻柔的聚焦超声打断法,效率更高,因而样本无需长时间固定(2.5min-5min-10min)


图1.相同细胞不同固定时间(0-2-5-10-15-20min)在相同超声条件下所产生的染色质片段。
*圆圈所指部位是固定过度(20min)后产生的片段化困难的大分子聚合物。


图2. 随着固定时间的增长,蛋白对IgG的非特异性结合显著升高

二. Shearing buffer中的SDS浓度

一般水浴超声和探头超声打断的ChIP protocol,往往是一步法细胞裂解和染色质片段化同时进行,这需要使用含高浓度去垢剂(1%甚至更高)的超声打断buffer,同时需要高超声能量。

但是高浓度的SDS对抗原表位的损伤很显著。抗原表位负责与抗体结合,对免疫共沉淀的成功至关重要。因而在IP前,往往需要进行10倍以上稀释,再加入抗体进行IP。这也增加了抗体的消耗。此外一步法的产率一般会显著少于两步法(先裂解细胞,再破核进行染色质打断)。

另外一种Covaris AFA聚焦超声,由于其聚焦超声能量利用率高、温控好,且采用两步法进行优化,因而可以支持低浓度SDS浓度(0.1%)的超声打断buffer,可以直接进行下游IP,无需稀释,提高产率的同时,也节约了抗体成本。


图3. 随着shearing buffer中SDS浓度的升高,ChIP的富集倍数显著降低。

三. 染色质片段化时间优化

不是片段化越彻底,结果就会越好。分布紧密的DNA碎片看起来赏心悦目,上面结合的蛋白却很有可能已经遭受表位受损。使用温控不好的片段化仪器,生物大分子分分钟降解;即使是优秀的温控仪器,长时间的剪切力也会对抗原表位造成损伤。请在抗原表位和染色质片段化效果中找到一个平衡,以达到最佳的实验效果。因而我们建议需要进行超声打断梯度摸索优化实验。特别推荐在片段化后使用ChIP抗体对抗原表位进行验证,在条件摸索阶段尽可能监控更多的步骤,提高实验成功率。

下面是两种传统染色质超声片段化方法的比较,建议选用更好的超声片段化仪器进行片段化。保证ChIP实验样本制备的质量,以免影响后期实验。

水浴超声

▪ 缺少超声能量控制;
▪ 超声能量不聚焦,大部分能量转换为热能,缺少温控,损伤蛋白抗原表位;
▪ 需要多次优化条件;
▪ 需要高浓度SDS剪切buffer;
▪ 需要高超声能量,易损伤染色质,因而往往需较长甲醛固定时间来减少染色质损伤;
▪ 超声换能器功能衰减;

探头超声

▪ 高温金属探针插入样本,损伤蛋白抗原表位;
▪ 样本与样本的打断结果差别较大;
▪ 难处理微量样本;
▪ 需要高浓度SDS剪切buffer;
▪ 需要高超声能量,易损伤染色质,因而往往需较长甲醛固定时间来减少染色质损伤;
▪ 探头易造成样本间交叉污染;
▪ 噪音大;

因而针对以上这些ChIP 样本处理优化,我们推荐使用Covaris AFA聚焦超声和truChIP超声试剂盒解决方案。

四. 为什么推荐Covaris?

Covaris采用高频率短波长的医用级别超声波,超声能量强,作用彻底。与所有传统的基于超声的样本处理方法不同,Covaris采用聚焦超声技术,仪器与样本不进行接触,球型换能器产生超声聚焦作用于样本,能量利用率极高,方向和力度精准可控,处理重复性好。仪器功率低,效率好,整个系统无过多热能,温控良好。


Covaris ChIP解决方案优势

▪ 易优化并通用的protocol:Covaris全套解决方案将摸索时间缩短至1-2周;
▪ 高重复性:AFA精确控制,系统稳定,完成条件摸索后即可稳定的得到好的结果;
▪ 良好的温控:AFA等温处理,保护蛋白抗原表位,提高免疫沉淀和DNA的回收率;
▪ 超低起始量:FFPE样本、稀少珍贵的细胞组织做ChIP也可保障简便高效、高得率;
▪ 剪切金标准:Covaris片段化重复性、剪切无偏好、片段长度分布均为测序业内金标准;
▪ 低SDS剪切:可选SDS或非离子剪切缓冲液,SDS用量仅为常规方法1/10,减少SDS对IP过程中抗体的影响,无需进行样品稀释直接用于下游IP,提高IP效率。

基因有限公司作为Covaris公司中国区独家代理商,为您提供DNA 片段化、ChIP实验、FFPE样本核酸提取、蛋白提取解决方案等。基因有限公司的宗旨是“专才为专家服务”,有专业团队为各大科研机构提供安装培训,技术支持,应用培训与售后维护一条龙服务,赢得客户的一致好评与信任。想要了解更多,请关注我们的官方微信“基因快讯”或联系您身边的基因有限公司员工。

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