干货 | ChIP实验样本处理优化指南

ChIP即染色质免疫共沉淀技术，是研究蛋白质-DNA相互作用的常用实验技术，在表观遗传学和转录因子调控研究中被广泛应用。ChIP实验繁琐复杂，任何一个环节的失误都会导致整个实验的失败。ChIP实验的各种优化方案也是层出不穷。今天为大家总结一些独家ChIP实验优化秘籍，帮助各位挣扎在ChIP上的实验汪们早日脱离苦海。

我们先来看下ChIP实验流程：

ChIP实验是一个研究蛋白质和DNA相互作用的实验，因此，在这个实验中有三件事情，是最重要的：

1)要维持蛋白质和DNA手拉手的状态（固定交联要恰当）
2)抗体要能够成功识别蛋白质（抗原表位要保护好）
3)DNA的检测--下游PCR和测序要能成功（染色质片段化要均一彻底）

ChIP实验的条件是一定要进行优化的，下面我们来看看哪些部分需要着重优化和注意的呢？

一. 固定试剂以及固定时间

1) 固定试剂的选择别忽略

固定用的甲醛试剂常常被忽略。很多实验室常用的37%甲醛其实并不适合用于ChIP实验固定细胞和组织。

首先37%甲醛溶液含有甲醇：甲醇起到稳定剂的作用，可以防止氧化和甲醛缩聚，但是甲醇存在的情况下，更容易有较大分子量的染色质产生，而这些染色质不容易被打断。

其次37%甲醛是多聚甲醛，多聚甲醛会形成不同的多聚体，每种多聚体的固定效率不同，造成每次的细胞固定差异导致重复性的降低。用粉末状的多聚甲醛配制固定液也同样不推荐。

推荐大家使用16%单体甲醛溶液（ChIP级别），仅含有甲醛单体，无复合物，可以提供最好的、最准确的固定结果。最推荐的是即开即用的小支包装，如CST的12606S。

2) 建议进行甲醛固定时间的优化

绝大部分实验汪们固定的时间太久了，固定不仅与细胞系相关，甚至于蛋白抗原表位也相关。 固定时间过长不仅会使蛋白质-DNA聚合物过于紧密，导致片段化困难、解交联困难，还会导致蛋白空间结构变化，损伤抗原表位，使得抗体难以成功识别结合。当然固定时间也不要过短。

不是所有的细胞都以同样的速率得到固定，因此针对不同的细胞和组织，对固定和打断时间进行梯度实验就非常重要，建议在优化实验时，用western blot 检查蛋白表位的完整性。

另外传统的水浴和探针超声法使用超高超声能量打断染色质，因此为了减少该过程对染色质的损伤，这些方案一般会要求延长甲醛固定时间（≥10min）。

相对来说Covaris的高频短波长聚焦超声（(Adaptive Focused Acoustics ，AFA），是轻柔的聚焦超声打断法，效率更高，因而样本无需长时间固定（2.5min-5min-10min）

图1.相同细胞不同固定时间（0-2-5-10-15-20min）在相同超声条件下所产生的染色质片段。
*圆圈所指部位是固定过度（20min）后产生的片段化困难的大分子聚合物。

图2. 随着固定时间的增长，蛋白对IgG的非特异性结合显著升高

二. Shearing buffer中的SDS浓度

一般水浴超声和探头超声打断的ChIP protocol，往往是一步法细胞裂解和染色质片段化同时进行，这需要使用含高浓度去垢剂（1%甚至更高）的超声打断buffer，同时需要高超声能量。

但是高浓度的SDS对抗原表位的损伤很显著。抗原表位负责与抗体结合，对免疫共沉淀的成功至关重要。因而在IP前，往往需要进行10倍以上稀释，再加入抗体进行IP。这也增加了抗体的消耗。此外一步法的产率一般会显著少于两步法（先裂解细胞，再破核进行染色质打断）。

另外一种Covaris AFA聚焦超声，由于其聚焦超声能量利用率高、温控好，且采用两步法进行优化，因而可以支持低浓度SDS浓度（0.1%）的超声打断buffer，可以直接进行下游IP，无需稀释，提高产率的同时，也节约了抗体成本。

图3. 随着shearing buffer中SDS浓度的升高，ChIP的富集倍数显著降低。

三. 染色质片段化时间优化

不是片段化越彻底，结果就会越好。分布紧密的DNA碎片看起来赏心悦目，上面结合的蛋白却很有可能已经遭受表位受损。使用温控不好的片段化仪器，生物大分子分分钟降解；即使是优秀的温控仪器，长时间的剪切力也会对抗原表位造成损伤。请在抗原表位和染色质片段化效果中找到一个平衡，以达到最佳的实验效果。因而我们建议需要进行超声打断梯度摸索优化实验。特别推荐在片段化后使用ChIP抗体对抗原表位进行验证，在条件摸索阶段尽可能监控更多的步骤，提高实验成功率。

下面是两种传统染色质超声片段化方法的比较，建议选用更好的超声片段化仪器进行片段化。保证ChIP实验样本制备的质量，以免影响后期实验。

水浴超声

▪ 缺少超声能量控制；
▪ 超声能量不聚焦，大部分能量转换为热能，缺少温控，损伤蛋白抗原表位；
▪ 需要多次优化条件；
▪ 需要高浓度SDS剪切buffer；
▪ 需要高超声能量，易损伤染色质，因而往往需较长甲醛固定时间来减少染色质损伤；
▪ 超声换能器功能衰减；

探头超声

▪ 高温金属探针插入样本，损伤蛋白抗原表位；
▪ 样本与样本的打断结果差别较大；
▪ 难处理微量样本；
▪ 需要高浓度SDS剪切buffer；
▪ 需要高超声能量，易损伤染色质，因而往往需较长甲醛固定时间来减少染色质损伤；
▪ 探头易造成样本间交叉污染；
▪ 噪音大；

因而针对以上这些ChIP 样本处理优化，我们推荐使用Covaris AFA聚焦超声和truChIP超声试剂盒解决方案。

四. 为什么推荐Covaris？

Covaris采用高频率短波长的医用级别超声波，超声能量强，作用彻底。与所有传统的基于超声的样本处理方法不同，Covaris采用聚焦超声技术，仪器与样本不进行接触，球型换能器产生超声聚焦作用于样本，能量利用率极高，方向和力度精准可控，处理重复性好。仪器功率低，效率好，整个系统无过多热能，温控良好。

Covaris ChIP解决方案优势

▪ 易优化并通用的protocol：Covaris全套解决方案将摸索时间缩短至1-2周；
▪ 高重复性：AFA精确控制，系统稳定，完成条件摸索后即可稳定的得到好的结果；
▪ 良好的温控：AFA等温处理，保护蛋白抗原表位，提高免疫沉淀和DNA的回收率；
▪ 超低起始量：FFPE样本、稀少珍贵的细胞组织做ChIP也可保障简便高效、高得率；
▪ 剪切金标准：Covaris片段化重复性、剪切无偏好、片段长度分布均为测序业内金标准；
▪ 低SDS剪切：可选SDS或非离子剪切缓冲液，SDS用量仅为常规方法1/10，减少SDS对IP过程中抗体的影响，无需进行样品稀释直接用于下游IP，提高IP效率。

基因有限公司作为Covaris公司中国区独家代理商，为您提供DNA 片段化、ChIP实验、FFPE样本核酸提取、蛋白提取解决方案等。基因有限公司的宗旨是“专才为专家服务”，有专业团队为各大科研机构提供安装培训，技术支持，应用培训与售后维护一条龙服务，赢得客户的一致好评与信任。想要了解更多，请关注我们的官方微信“基因快讯”或联系您身边的基因有限公司员工。