SARS小鼠模型的构建策略与应用进展

作者 ；俞晓峰 博士，高级科学家

在全国疫情逐步清零时，北京的疫情却出现了“反弹”，牵动着全国人民的心。截止6月18日24时，北京8天内已出现新增确诊病例183例，还有一些主动筛查中发现的无症状携带病例。这无疑在告诉我们每一个人：疫情尚未结束，仍需加强防疫！

对于中国乃至整个世界来说，由新冠病毒（SARS-CoV-2) 引起的全球新冠肺炎（COVID-19）大流行疫情，都是一个巨大的挑战。深入研究严重急性呼吸综合症（SARS）与宿主分子相互作用机制，探讨病毒致病过程，建立SARS病毒感染疾病模型，对于指导临床治疗、疫苗和药物研发，都具有非常重要的意义。不论是疫苗研发还是新药研发，以及基因治疗，均需要精准的动物模型来验证疾病的发病和免疫机制。

一、应用小鼠模型研究SARS的意义与优势？

在研究人病毒感染性疾病中，小鼠模型优势是非常明显的，比如，成本较低、容易繁殖饲养、繁殖较快和产仔数较多。更重要的是，近交系小鼠的遗传背景具有一致性，在此基础上，可对小鼠基因进行相应的编辑改造建立需要的模型，这都无疑有助于研究宿主特定基因在病毒致病过程中的影响作用，也有利于深入了解病毒或疫苗引起的宿主免疫系统反应及其免疫保护作用。

当然，小鼠模型也存在局限性。由于病毒感染人体或小鼠细胞，常常是通过与宿主体内特殊的细胞表面受体结合，与宿主的先天免疫反应等因素有关，而且，小鼠与人之间的存在一定的物种差异性，导致一些人病毒无法直接感染小鼠，或人病毒虽能在小鼠体内复制，但却难以引起感染疾病明显的症状表现。所以，将小鼠模型研究结果转化为人体时，需要谨慎小心。但是，利用各种类型的基因编辑小鼠、人源化小鼠、或者遗传多样性的小鼠品系等，从某种程度上可以克服野生型小鼠的短处，使小鼠模型成为研究宿主与病毒致病相互作用，评价疫苗与药物安全性及有效性的非常有用的研究工具。

二、应用小鼠模型研究SARS-CoV有哪些策略与方法？

根据小鼠构建策略与方法不同，目前SARS-CoV感染小鼠模型分为三种：

1. 应用人SARS-CoV病毒直接感染近交系小鼠；
2. 应用基因编辑小鼠技术，敲除小鼠相关基因，或将人宿主细胞SARS病毒结合受体（比如ACE2）转入小鼠体内；
3. 将野生型SARS-CoV病毒在小鼠体内进行反复适应进化过程，获得致病性更强的小鼠适应病毒，从而建立能引起明显临床表型的病毒感染小鼠模型。

关于SARS-CoV感染小鼠模型，主要的研究进展集中于以下几个方面：

（1）直接应用近交系小鼠模型研究SARS病毒致病性

由于SARS-CoV感染人群造成病死率的增加，与年纪较大的患者（大于60岁）发生严重急性呼吸道困难综合症（ARDS）的增加有关，为了探讨能模拟老年人感染SARS-CoV更适合的小鼠模型，有研究分别应用12-14月大的BALB/c、C57BL/6和129S6近交系野生小鼠进行实验，结果发现，此三种老年小鼠经SARS-CoV感染后，都有短暂（平均约7天左右）的临床症状表型，比如体重减少、乱的毛发、弓背和脱水等，更为重要的是，在组织病理学方面，表现有血管周围和细支气管周围炎性细胞渗入，细支气管细胞坏死，以及间质性肺炎发生等现象。而且，BALB/c小鼠的广泛肺泡破坏可持续到第9天，非常接近人SARS-CoV感染的临床病理症状。该研究也是第一次阐明了不同宿主遗传及年龄特征，可以显著影响SARS-CoV感染致病性强弱，同时也再次表明，病毒感染性疾病的发生，不仅与病毒本身特性有关，宿主自身相关因素也发挥极为重要的作用。
 
(2) 应用基因编辑技术建立SARS病毒感染小鼠模型

关于hACE2遗传修饰人源化小鼠模型的构建策略，目前通常应用不同的组织特异性或广泛表达启动子与hACE2基因构建的表达载体，通过原核注射的方法，获得随机插入的转基因小鼠模型，比如，细胞角蛋白（上皮细胞特异性表达-K18）启动子；CAG启动子（广泛表达）或小鼠ACE2基因启动子。应用这些ACE2人源化小鼠模型的研究结果表明，hACE2的表达水平高低与其疾病的严重程度直接相关。虽然，这些小鼠模型都表现有呼吸道上皮细胞感染，但同时在小鼠脑部也可见高表达的hACE2基因，并在SARS-CoV感染模型中发现，病毒量在小鼠脑部的增加与广泛扩散，最终导致小鼠发生脑炎而死亡。
 
(3) 应用适应实验进化方式获得SARS-CoV变异强毒株

通过将病毒种植在小鼠特异性组织中，进行适应进化，迫使病毒适应其特定生存环境，并在特定的选择压力下发生突变，以达到更有利于其有效复制的目的。为了让SARS-CoV适应在野生小鼠肺部复制，并引起严重急性呼吸道疾病表型，研究者通过对BALB/c小鼠（6周龄）鼻腔反复接种SARS-CoV临床株15次,直到野生小鼠出现明显的人感染SARS-CoV的临床症状（比如体重下降等）。通过比较不同传代获得的适应致死病毒株，有助于分析病毒引起严重呼吸道致病毒力的变化与其蛋白特定突变间的相互关系，为进一步研究特异性SARS-CoV蛋白适应性突变在病毒宿主间作用联系提供了方便。

(4) 应用协同交配（Collaboratory Cross-CC）技术建立遗传背景多样性小鼠品系

应用CC小鼠品系建立SARS-CoV感染模型，有助于寻找在病毒致病过程中，是哪些遗传相关影响因素，决定了宿主对病毒感染性疾病的不同反应。通过用SARS-CoV感染CC小鼠后，分析比较不同表型的CC品系小鼠，比如体重减少的高与低，或病毒滴度的高与低等，达到快速确定与表型相关基因的目的。利用CC小鼠技术，有研究者从SARS-CoV感染致病过程中，寻找到对病毒敏感性完全相反的CC小鼠品系（CC003和CC053/Unc)，基因定位分析发现，在Toll样受体信号通路中的适配体蛋白Ticam2，是决定严重呼吸道疾病表型的潜在关键因子。基于这类研究的结果表明，CC小鼠可作为更加客观模拟人病毒感染疾病临床表型的一种新型小鼠模型。

三、小鼠模型在新冠病毒（SARS-CoV-2）研究中的应用进展

无论是核酸还是氨基酸序列比较分析都证实，SARS-CoV-2与SARS-CoV的相似性非常高 （分别约为80%和76%），而且SARS-CoV-2也是通过细胞表面的ACE2受体与宿主发生相互作用，引起与SARS-CoV感染相似（虽然不是完全相同）的严重急性呼吸道困难综合症等临床表现。因此，上面介绍的针对SARS-CoV感染的相关小鼠模型构建策略与方法，也适合于SARS-CoV-2感染小鼠模型的建立。 目前小鼠模型在新冠病毒感染研究中的最新应用研究都是由中国科学家们完成。

1. 转基因人源化ACE2小鼠模型

中国医学科学院医学实验动物研究所秦川主导的研究团队全球首先报道建立新冠病毒感染hACE2小鼠模型，该转基因hACE2小鼠模型是应用小鼠mAce2启动子和hACE2基因构建的表达载体，通过原核注射方法获得动转基因hACE2小鼠模型。hACE2转基因小鼠受到SARS-CoV-2病毒感染后，小鼠会出现了体重下降，小鼠肺部可检测到高水平的病毒载量，且病毒感染小鼠出现中度间质性肺炎，肺泡间质中大量淋巴细胞和单核细胞浸润，肺泡腔内巨噬细胞聚集等病理学特征。

另外，研究者们还首次应用该hACE2转基因小鼠对新冠病毒灭活疫的安全性与有效性进行了评价。实验结果表明，不同剂量和不同时间的灭活疫苗免疫hACE2小鼠，未观察到小鼠出现炎症和不良反应。检测分析灭活疫苗的免疫原性显示，小鼠体内可被诱导产生针对SARS-CoV-2的S蛋白和RBD特异性的IgG，且针对RBD特异性的IgG占S蛋白抗体反应高达50%，提示RBD是新冠病毒灭活疫苗的主要免疫原。

2. 定点插入人源化hACE2小鼠模型

中检院实验动物资源研究所主导的研究团队首次报道成功构建定点插入hACE2-KI/NIFDC小鼠模型。该人源化小鼠构建策略是将hACE2基因定点插入小鼠mAce2基因启动子之下，并将tdTomato基因插入到hACE2基因的下游，使该人源化小鼠在内源性mAce2基因的调控下，共表达hACE2和tdTomato基因。SARS-CoV-2病毒经鼻感染青年和老年hACE2小鼠感染后，小鼠的肺、气管和脑中均出现较高的病毒载量，而在小鼠脾、肾、肝、肠和血清中没有发现病毒RNA。青年和老年hACE2小鼠均发生了间质性肺炎，表现为炎性细胞浸润、肺泡间隔增厚和明显的血管系统损伤。但未见感染小鼠死亡。分析SARS-CoV-2感染小鼠的主要靶细胞表明，Clara细胞分泌蛋白（CC10）阳性Clara细胞是SARS-CoV-2在气道中的主要靶细胞。

研究还证实，胃内接种SARS-CoV-2也可引起hACE2小鼠感染，并导致hACE2小鼠发生肺部病理变化。

3. 腺病毒载体制备的小鼠模型

广州呼吸疾病国家重点实验室赵金存教授团队利用腺病毒载体（Ad5) ， 在小鼠肺脏转导表达hACE2，成功建立全球首个非转基因新冠肺炎小鼠模型。

通过构建CMV启动子表达hACE2基因的腺病毒（Ad5） 载体(Ad5-CMV-hACE2), 分别经鼻内转导的方式，在野生小鼠和相关基因敲除小鼠（I型干扰素受体缺陷小鼠或干扰素通路关键基因STAT1敲除小鼠）基础上，建立小鼠肺部表达hACE2基因的小鼠模型。

该种非转基因人源化hACE2小鼠经SARS-CoV-2感染后，小鼠肺部可检测到高滴度病毒，并出现体重下降和类似新冠肺炎病人的临床病理表现。同时，该小鼠模型实验也证明，I型干扰素和STAT1基因具有潜在抗SARS-CoV-2感染的保护作用。

赛业生物作为模式动物领域发展的领先者，在新冠肺炎疫情爆发初期，便组织研发团队全力开发新冠小鼠模型。我们利用自主研发的TurboKnockout技术和经过优化的CRISPR-Pro技术同步开展BALB/c、C57BL/6J、C57BL/6N三种背景品系的人源化hACE2小鼠制备，并综合考虑不同基因编辑方式的优缺点，设计了多种基因打靶方案与构建策略，以满足不同研究目的和不同应用方向的需求。

新冠肺炎疫情发生到现在已经有半年时间，而疫苗和抗病毒药物的研发逐渐明朗，虽然不能马上用于感染者进行预防和治疗，但抗疫取得了阶段性的胜利是有目共睹的。在这个过程中，小鼠成了人类抗病毒感染之路上的伟大助手，实现了它对人类的最大价值。人类共同命运，生物和谐生存，愿我们拥有一个更美好的地球家园。

俞晓峰 博士，高级科学家

俞晓峰博士现任赛业模式生物副总裁、高级科学家，负责基因修饰模式动物的研发与技术服务等工作。俞博士在遗传基因模式动物领域有超过20年研发与管理等方面的丰富经验，在干细胞相关领域及哺乳动物细胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次发表在Nature Immunology，Hum Mol Genet，Mol Cell Biol 等高水平杂志上。加入赛业生物前，俞博士2010-2013年任职于美国应用干细胞（ASC）公司，担任研发总监，负责基因修饰模式动物的研发与定制服务，并在中国子公司斯坦福生物科技担任副总裁一职。2009-2010任纽约大学医学院研究员。2003-2009期间任职于美国基因打靶公司（iTL），作为资深科学家和项目经理负责参与了基因修饰小鼠模型研发方案与策略设计、项目管理、技术人员指导与培训、以及客户服务和技术咨询等方面工作，2007年起负责开发了p53基因不同点突变的人源化肿瘤小鼠模型库项目。2000年任美国耶鲁大学医学院研究员。1995年获得军事医学科学院博士学位。