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不光有序列,还要有定位——原位测序的最新进展

【字体: 时间:2020年07月13日 来源:生物通

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  原位测序(in situ sequencing,ISS)是一种新方法,可以对固定组织或细胞样本中的mRNA进行直接测序。原位测序的强大之处在于发现测序信息与其位置(比如亚细胞定位)之间的关联。

原位测序(in situ sequencing,ISS)是一种新方法,可以对固定组织或细胞样本中的mRNA进行直接测序。原位测序的强大之处在于发现测序信息与其位置(比如亚细胞定位)之间的关联。这显然与常规测序不同,后者是将样本与环境分离,因此丢失了位置信息。

几年前,瑞典斯德哥尔摩大学Mats Nilsson领导的研究团队开发出原位测序。该方法依赖一种锁式(padlock)探针,它与目标序列的任一侧杂交,形成环状模板进行复制。由于产物是拴在模板上的,这便提供了可靠定位,之后通过连续的寡核苷酸探针掺入,实现原位测序。如今,原位测序有了一些新发展和新应用。

原位测序升级版

Nilsson的研究团队开发出一种新方法,称为基于杂交的原位测序(HybISS)。与之前的方法一样,它采用锁式探针进行滚环扩增。不过,探针设计经过改进,可建立新的条形码系统,以提高空间检测的灵敏度。

研究人员认为,HybISS有望应用于细胞图谱(cell atlas)项目,建立全面的空间参考图。不过,原位测序的负责人Chika Yokota表示:“建立整个器官或组织的完整基因表达谱仍需要大量时间。我们还需要进一步提高通量。”

HybISS还能够帮助人们抗击新型冠状病毒。“HybISS可以与检测不同免疫细胞群的探针一起使用,以便观察COVID-19患者不同组织样本中的不同免疫反应,”Yokota谈道。“这将帮助我们生成COVID-19的空间分辨免疫细胞谱。”

商业化的原位测序工具

瑞典公司Cartana如今已经将Nilsson团队开发的分子工具商业化。Cartana的转录本空间分析工具主要是利用靶向方法来实现细胞类型的映射。Cartana的研发部门负责人Malte Kühnemund表示:“ 这属于基础生物学,也可用来回答特定的问题,比如是否存在潜在的药物靶点?它在哪种细胞中表达?”

目前,Cartana技术已被应用在人和小鼠的12种组织上以及不同类型的肿瘤上。此外,它还能够鉴定组织内的免疫细胞。“如果你可以定位和鉴定肿瘤内的免疫细胞,那么你就可以观察到肿瘤的浸润程度,并评估免疫反应有多少,”Kühnemund说。“这是一个热门的应用,因为你可以通过它来定制癌症疗法。”

针对新型冠状病毒,Cartana也设计了独特的锁式探针。Kühnemund说:“利用来自COVID-19患者的组织样本,我们试图确定病毒的位置,并看看有哪些类型的细胞与之相重叠。”

然而,原位杂交的数据分析仍具有挑战性。Cartana正在开发软件来积极应对这一挑战。Kühnemund认为,随着这一新兴领域的成熟,以及越来越多的人开始使用这种技术并开发开源工具,这些困难将得到克服。未来,人们可利用这种技术来评估癌症治疗的效果,并开发出更好的药物。

荧光原位测序 – FISSEQ

与Cartana的靶向原位测序方法不同,哈佛医学院大名鼎鼎的George Church实验室开发出一种非靶向的方法,名为荧光原位测序(FISSEQ)。此后,Wyss研究所首席科学家Richie Kohman又领导团队开发出不同版本的单细胞原位测序,对RNA、DNA、病毒RNA以及蛋白进行靶向分析。“这些版本的差异体现在前面几步,而测序、成像和数据分析都是相似的,”他说。

Kohman相信,科学界很快将会解决ISS的一些挑战。“我们的目标捕获和样本制备方案都非常完善,任何人都能轻松上手,但对于一些新入门的实验室来说,原位测序的硬件工程和图像分析仍然有难度,”他说。Wyss研究所的附属公司ReadCoor已经取得FISSEQ的技术授权,正在开发全包式的解决方案。

原位测序和RNA结合蛋白

FISSEQ那篇文章的主要作者是Je Lee,他现在是冷泉港实验室的助理教授,正在开发其他的原位测序方法。Lee研究团队的最新成果是INSTA-seq(in situ transcriptome accessibility sequencing),文章现正处于审稿阶段。在此,他们开发出一种双向双端测序方法,能够原位读取单个DNA分子的短分子条形码,而不是像以往的方法那样用探针进行靶向检测。

在对细胞或组织进行荧光成像后,他们利用12个碱基的条形码来沉淀感兴趣的DNA分子,从而实现基因表达分析,其读长超过300个碱基。这种方法还可以检测RNA结合蛋白的足迹,从而提供调控信息。因此,它能够原位绘制mRNA与调节性RNA结合蛋白之间的相互作用。

Lee相信,原位测序有望改变功能基因组学。“在您以核苷酸的分辨率精确定位单个细胞内的分子机制时,它改变了如何回答细胞间相互作用如何影响基因调控这个问题的流程,”他说。“我认为,空间功能基因组学是原位测序的未来。”

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