生物通 | 新技术专栏

还在走弯路?科研大神细胞外囊泡研究方案大公开!

【字体: 时间:2020年07月22日 来源:Takara

编辑推荐:

  EV作为体液中的“微小物质”,光是有效分离就难点重重,又该如何顺利开展下游应用呢?No worries,一起看看科研“大神”的经验分享!

(领导说这期我们主要讲细胞外囊泡)

接到领导任务,小编不敢懈怠,潜心研究Pubmed等数据库中各位大神所发表的细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EV)相关论文、研究思路、方案,发现近5年所发表的EV相关论文超过11000篇,且逐年上升,涵盖肿瘤、药物递送介导等热门领域。

(来源:Pubmed “Extracellular Vesicles”关键词搜索)

回头看看今年。

虽受疫情影响,但2020年上半年EV相关文献发表数量仍超1800篇,全年有望超过2019年的3551篇。

那么细胞外囊泡的研究会持续引发关注吗?

——————————————--我是突然开始的科普———————————————

细胞外囊泡是细胞在静息或应激状态下释放的各种具有脂质双层膜结构的囊泡总称,广泛存在于细胞培养上清以及血液、尿液等体液中,按照功能、形成机制、大小还可以进一步区分为外泌体、微囊泡和凋亡小体等结构。

经过近三十载研究,EV被认为是第三种细胞间通讯方式,是机体内天然存在的生物信息传递载体。主要机制为:EV形成过程中,其母细胞内的多种生物信息分子,如蛋白质、脂类、核苷酸等会被调控分选入EV,并随之被转运至邻近或远处的受体细胞,并释放和传递其所携带的生物信息分子,发挥调控生理病理过程的作用,如激活抗肿瘤免疫、参与神经突触生长等。不仅如此,EV由其表面蛋白质的优势,可以被改造为疾病治疗工具,如药物输送媒介。

因此对EV及其内含物的研究给转化医学发展带来了希望,受到科研人员广泛关注。但是,EV作为体液中的“微小物质”,光是有效分离就难点重重,又该如何顺利开展下游应用呢?

No worries,一起看看科研“大神”的经验分享!

——————————————---注意,前方高能---------————————————

1、要想下游应用不出错,EV分离要做好

实验小白:EV分离耗时长、纯度低

大神:还用“蛮力”?EV分离要靠“巧劲”

EV的分离,超速离心是最常接触的方法。然而,由于EV存在大小差异,离心速度可从18000g到100000g不等,科研人员需要考虑合适的离心时间与速度,以使膜性囊泡沉降最大,破坏最小。同时,生物体液中还存在脂蛋白、病毒等粒子会与EV共同沉淀,使EV纯度下降。

大神EV分离攻略大公开↓

来自斯坦福大学的Ke Yuan博士[1]在其课题中采用了一种新型的Capturem膜技术,分离获得完整的外泌体,用以开展与肺高压相关的研究,并最终获得理想的数据。

Capturem为Takara科学家潜心研发,更为简便高效的EV分离技术。通过向Capturem膜上偶联基于凝集素的EV结合化合物,Takara推出Capturem™ Extracellular Vesicle Isolation Kit,无需超速离心即可在30 min内从血液、尿液、唾液等体液中分离出高纯度、足够量的EV,且操作重复性好,用于下游转录组测序、蛋白质组分析或qPCR分析等。


操作简便,只需500g离心洗涤、洗脱等几步操作,即可获得一致性高、纯度高的EV产物。


Capturem分离的EV,纯度更高。采用两种方法从500 μl血浆中分离EV,重复三次。结果显示,Capturem捕获的EV粒径变化小,平均粒径大小为81 nm(D90=110 nm),超速离心获得的EV粒径变化大,平均粒径大小为135 nm(D90=203 nm)。

2、探讨EV分子功能,正确解析内含物尤为关键

实验小白:分子机制?Biomarker?范围太广,我太南了!

大神:送EV RNA-Seq“原地出道”!

前面提到,EV包含多种生物活性物质,其中RNA和蛋白质受关注较多。特别是EV RNA,已有大量“它们作为肿瘤早期生物标志物”的报道见各大期刊。

其分子作用大致为:EV中微量的RNA分子可随EV经循环系统传递到靶组织吸收,发挥蛋白质表达、转录调控等重要生理作用。

因此采用NGS技术解析EV中编码(e.g.mRNA)与非编码RNA(e.g.lncRNA)的组成与差异表达,意义非凡!
不过,EV RNA-Seq远没有想象中容易,主要难点在于NGS文库构建↓

(1) RNA含量低、存在降解
(2) 存在rRNA干扰

大神EV RNA建库攻略大公开↓

来自哈佛医学院的Saumya Das博士[2]团队致力从人血浆及EV中寻找lncRNA作为Biomarker,用于后续的临床应用。为此,Saumya博士团队谨慎评估了多款建库试剂盒,希望获得更正确的lncRNA分析数据。经过第一轮“公演”,来自Takara的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian(Pico v2)以其获得最多的154942条long RNA transcript(血浆)及高度可重复性,作为唯一“参赛选手”入围EV RNA-Seq文库构建环节,并最终取得67297条long RNA transcript的好成绩。

国内亦有团队采用Pico v2分析EV编码与非编码RNA。

北京恩泽康泰研发团队选取9例血浆EV来源total RNA作为起始样本,input量约为2 ng,采用Pico v2进行文库构建,并用于lncRNA、mRNA的分析。当FPKM≥1时,lncRNA检测数为2000~4500,mRNA的检测数接近10000!数据质量良好!

以上图片与数据来源于北京恩泽康泰生物科技有限公司

大神爱用Pico v2构建EV RNA-seq文库,why?

因它能解决EV RNA建库两大难题:

▪ Pico v2支持pg级别total RNA起始,即使RIN值低至2,也可获得高品质链特异性Illumina文库。→无惧EV RNA含量低、品质不高
▪ Pico v2采用Zap R、R probes技术,无需前处理rRNA;操作更简便的同时,去除了rRNA的干扰。→无惧rRNA干扰

3、有上万例EV RNA要做qPCR,如何减小操作误差?

除了NGS分析,EV中RNA的qPCR定量也是大多数研究人员选择的方法,特别是miRNA的定量。

临床科研工作者往往有大量的EV RNA样本亟待分析。面对数量巨大的样本和检测位点,除了耗费科研人员的人力、时间、成本外,实验操作带来的误差也不可忽视。可一次在特制芯片上进行高达5184次反应的高通量qPCR系统能大大降低大样本量检测的实验难度与误差,提高正确度!


SmartChip Real-Time PCR System

Takara Bio USA的科学家应用SmartChip Real-Time PCR系统对Capturem分离的EV样本同时进行了1,200个miRNA靶标筛选,结果…

STOP!!!(领导紧急喊卡)

一次爆光太多大神的经验容易没饭恰,本期EV篇就先到这儿。[捂脸]

当然完整爆料我们已po到“文末链接”……(不能提示更多)[认真脸]

参考文献:
1. Yuan, K., et al. Loss of endothelium-derived Wnt5a is associated with reduced pericyte recruitment and small vessel loss in pulmonary arterial hypertension. Circulation 139, 1710–1724 (2019).
2. Rodosthenous, et al. Profiling Extracellular Long RNA Transcriptome in Human Plasma and Extracellular Vesicles for Biomarker Discovery[J]. iScience 23, 101182 (2020).

更多大神EV研究爆料

Takara Bio中国官网                                                        

我来说两句
0  条评论    0 人次参与
登录 注册发布
最新评论刷新
查看更多评论 > >

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器云展台 | 免费试用 | 今日视角 | 新技术专栏 | 技术讲座 | 技术期刊 | 会展中心 | 中国科学人 | 正牌代理商

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号