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m6A调控这么火,我的研究中可以做吗?怎么做?

【字体: 时间:2020年07月22日 来源:吉凯基因

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  私下里经常有小伙伴来问:我的研究中可以做m6A吗?该怎么做呢?下面季博就带我们来看看关于m6A研究该怎么做?

随着m6A研究相关的各种高分paper的不断发表,m6A调控成了这一两年科研界的宠儿,吉凯基因之前也做了两期关于m6A课题设计的线上直播。

私下里经常有小伙伴来问:我的研究中可以做m6A吗?该怎么做呢?下面季博就带我们来看看关于m6A研究该怎么做?

下面是转自季博的文章

讲座中经常讲到在课题研究之初需要筛选差异基因。按照提出的科学问题,进行分组,然后筛选组间的差异基因。基因的差异,可以分为3种。
 
1、突变
这个发生在遗传物质-核酸上。做基因组测序(全基因组测序或全基因组外显子测序)。

2、量的差异
也就是表达量的差异。可以是mRNA水平,也可以是蛋白水平。往往来说,对于蛋白编码基因来说,mRNA水平的差异,需要表现到蛋白层面才能有意义。做转录组测序或蛋白组。

3、修饰的差异
这个是在蛋白层面。蛋白活性的调控。修饰蛋白组(磷酸化蛋白组、乙酰化蛋白组、糖基化蛋白组、泛素化蛋白组等等)

以前讨论到这个地方的时候,就有教授提出,“基因表达发挥功能是有时空性的,应该还有空间分布的差异”。是的,研究中需要考虑基因表达的时空性。不过,蛋白的空间分布调控,往往是修饰调控。比如转录因子的磷酸化修饰可以调控其出核入核的分布。因此,这类我们还是归类到“修饰的差异”。只不过这个修饰调控了蛋白的空间分布。
 
m6A属于哪一类呢?m6A修饰是在腺嘌呤A的N6上进行了甲基化,发生在RNA上。调控了RNA的转录、剪切、成熟、稳定性、翻译等。最终影响的是基因“量的差异”。至于是RNA的量,还是蛋白的量?还是那句话,对于蛋白编码基因来说,需要最终体现在蛋白量上才能有意义。
 
讨论完这些,我们再讨论m6A调控相关的内容。RNA的m6A修饰调控,需要3样东西。

1、RNA甲基转移酶

m6A是甲基化修饰,因此需要甲基转移酶在RNA上加上甲基。在m6A修饰中,这类甲基转移酶叫作“writer”。

目前发现的有METTL3/14、WTAP、RBM15/15B、KIAA1429(VIRMA)。
 
2、去甲基酶

m6A修饰其实是细胞内调控基因表达的一种方式,这种方式是可逆的。已经被m6A修饰的RNA是可以被去甲基化的。这类去甲基酶叫作“eraser”。

目前发现的有FTO、ALKBH5。
 
3、m6A识别蛋白

类比于细胞内最主要的磷酸化调控修饰,加磷酸的为激酶,去磷酸的为磷酸酶,还有一类为识别磷酸化蛋白的磷酸化肽段结合蛋白,比如14-3-3(他介导很多磷酸化蛋白的出核入核哦)。m6A修饰中也存在这一类蛋白,专门识别结合m6A修饰的RNA,叫作“reader”。

目前发现的有YTHDF1/2/3、IGF2BP1、HNRNPA2B1。
 
前面这3个,是调控m6A修饰,在研究中,其实最终需要落到m6A修饰调控了谁,发挥了功能(促进或抑制了疾病)。也就是m6A靶基因。

所以,在m6A研究中,可以有4个方向:1、甲基转移酶;2、去甲基酶;3、m6A识别蛋白;4、m6A靶基因

OK,那么我们的研究中什么时候可以做m6A呢?怎么做?
 
一、靶基因层面

有临床的老师说,“我收集临床样本,疾病和正常。做m6A测序,找m6A修饰不同的基因,探讨这个基因是否与疾病相关”。

很好的思路。这个思路中,找的是什么m6A靶基因参与了疾病。

这样的课题与我们以往做的寻找参与疾病新功能基因课题,在机制探讨上多了该基因的调控为m6A。

比如以往我们是通过疾病和正常样品进行组学筛选,拿两组间有差异的基因。然后探讨这个差异基因是否在疾病发生发展中发挥功能,以判断是否为疾病的“新候选诊疗靶点”。最后探讨机制,上游探讨这个基因为什么在疾病中出现差异;下游是这个基因通过什么下游发挥功能。

现在与m6A结合起来,可以这样做组学

1、m6A测序与转录组结合
临床样品进行转录组及m6A测序。两个数据取交集。找m6A修饰有改变,同时mRNA量有差异的基因。
这个组合,假设的前提是m6A修饰可以影响mRNA的量。如果认为m6A会调控剪切,那么在转录组测序结果中分析splicing。

2、m6A测序与蛋白组结合
临床样品进行蛋白组及m6A测序。两个数据取交集。找m6A修饰有改变,同时蛋白量有差异的基因。
前面说,对于蛋白编码基因来说,不管mRNA怎么变,需要最终体现在蛋白量的改变上。因此,这里可以m6A测序直接与蛋白组进行组合。

3、m6A测序与转录组蛋白组结合
蛋白编码基因最终需要看蛋白量的改变,加上m6A的修饰。研究中仍然要回答m6A是怎么最终调控到蛋白量的。是在RNA转录水平?剪切?成熟?稳定性?还是翻译?因此,3个组学综合分析。

可以不结合其他组学,只做m6A测序吗?可以。不过,投往高分杂志的课题中,一定要探讨m6A修饰是怎么调控了靶基因,参与了疾病发生发展。
 
二、酶与m6A结合蛋白

m6A这两年发表了不少高分研究。其实,这类研究中最大的一个创新是把m6A的调控与某个疾病的发生发展联系了起来。从这个角度来说,在临床基础研究中探讨m6A,最好的创新是首次把m6A与疾病某个病理过程联系起来,这个是最佳的。

您研究什么临床问题,这个临床问题的发生,是否有人报道过m6A参与这个临床问题?如果没有,赶紧的。

如何做?

1、基因组

您如果研究遗传病,或者有遗传因素的疾病(比如高血压啥的),或者体细胞遗传病(我们指的是肿瘤)。把基因组测序中找到的突变或SNP,看看是否在m6A相关的酶或m6A结合蛋白上。如果在,看看这个位点是否在这个疾病中(临床问题中)发挥功能;如果发挥功能,看看是否为通过影响下游m6A的修饰而发挥功能。

这个思路是假设DNA上的突变发生在m6A相关酶或者结合蛋白上。其实,也可以假设在靶基因上,靶基因m6A修饰位点或者影响修饰位点的甲基化。
 
2、转录组蛋白组

在转录组或蛋白组中,m6A相关酶或结合蛋白是否为差异基因。这个是做得最多的情况。您做过临床样品的组学吗?组学差异基因中有m6A相关酶或结合蛋白吗?

a、如果您研究的疾病或临床问题中还没有人报道过m6A参与,而您的组学差异基因中出现了m6A相关酶或结合蛋白。赶紧做功能。这类创新是最佳。

b、如果已经有报道认为m6A参与,但您组学中找到的m6A相关差异基因别人没有报道过。赶紧做功能。这类创新是第二。

c、如果找到的差异基因是别人报道过的,但是我们还是想做m6A研究。那么就找靶基因了。创新性放到靶基因上。这种情况的创新,m6A带来的创新性不大,如果要让高分杂志认可,机制上得找其他创新。
 
3、修饰蛋白组

在研究领域,往往是基础研究先发现一类新分子调控方式,CNS级别文章。然后这类调控在重要疾病中发挥作用,CNS文章(现在有时候是新调控与疾病相关放在一篇文章中讲)。跟进的研究往往低一个层次,但有例外。就是这个分子调控本身又是怎么调控的。

m6A相关的酶,酶活是受谁调控?这类研究,从修饰蛋白组中去寻找答案。比如磷酸化蛋白组,您做的磷酸化蛋白组差异磷酸化蛋白中有m6A相关酶或结合蛋白吗?这个磷酸化位点的差异,是否影响其活性呢?这类创新,在目前m6A领域来说,是最高的。

总结:

m6A参与疾病的研究课题。

一、m6A测序

如果一定要做m6A参与疾病的研究,那么临床样品的m6A测序是一定要做的,从里面找靶基因。(不开刀不穿刺的疾病,用动物模型样品)

二、联合的组学

1、联合转录组蛋白组

转录组蛋白组有两个作用。

a、差异基因中找m6A相关的酶或结合蛋白。找有创新性的基因。
b、m6A靶基因在转录组和蛋白组中怎么样,评估m6A修饰对靶基因是调控了转录、剪切、稳定性还是翻译等等。把机制做严谨。
 
2、联合修饰蛋白组

如果能够找到m6A酶活或结合蛋白活性的修饰调控,创新性是最好的。

当我们发现疾病与正常之间m6A修饰是有差异的。但是在转录组和蛋白组中未检测到甲基转移酶和去甲基酶的差异。那么这个时候,一定要做修饰蛋白组看看,找酶活调控的修饰。

这个地方,先做磷酸化蛋白组,因为磷酸化调控是酶活调控最主要的。除了磷酸化之外,酶活调控修饰还可以做乙酰化、甲基化、糖基化、泛素化(单泛素化)等等。
 
如果m6A修饰在您所研究的临床问题中还没有报道过。赶紧做m6A测序联合转录组蛋白组。一定要从转录组或蛋白组中找到m6A相关酶。做这个酶的功能是否参与这个临床问题。

如果m6A修饰在您所研究的临床问题中已经报道过,您如果还想发表高分文章,建议联合修饰蛋白组,用m6A酶或结合蛋白活性调控作为创新机制之一。
 
另,m6A甲基转移酶、去甲基酶、结合蛋白。还有其他的吗?这个方向做得很基础了。如果您做的基因正好是个甲基转移酶或去甲基酶,做完基因干预后,可以做个m6A测序看看,如果有改变,说明其可能也调控m6A。

特别是RNA结合蛋白,这类蛋白有很多。您做完这个RNA结合蛋白功能后,做其结合RNA的测序找靶基因,这时,您可以同时做个m6A的测序看看。或者,在您找到其结合的靶基因后,把这个靶基因做个m6A修饰预测看看。尝试一下。

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